哈蟆油蛋白多肽的透皮作用研究

张玉尧，徐云凤，王 涵，李香艳，荆 礼，张 鹤,3

（1长春中医药大学/吉林省中药生物大分子重点实验室，长春130117；2长春金赛药业有限责任公司，长春130012；3长春中医院大学附属医院，长春130021）

0 引言

哈蟆油(Ranae Oviductus)是中国林蛙(Rana temporaria ChensinensisDavid)的干燥输卵管，也称林蛙油，是中国东北地区的名贵药材。具有“滋补软黄金”的美誉，是各种体虚、身体疲劳的理想滋补品，也是美容养颜、抗衰老[1]、抗氧化[2]、抗疲劳[3]的理想佳品。哈蟆油中含有丰富的蛋白质（含量高达56%）和对人体有益的不饱和脂肪酸、磷脂、激素、维生素及微量元素等[4]，这些天然成分易被皮肤吸收，加快细胞更新速度，减少黑色素生成，对细微皱纹、干燥和松弛的肌肤有营养滋润效果，防止皮肤皱纹的产生，有延缓老化和调节女性内分泌的明显功效[5]。目前中国林蛙及哈蟆油作为一种新的化妆品原料已被开发利用，刘春娟等[6]开发的林蛙油保湿乳液具有较好保湿性能。由于哈蟆油中含有大量胶原蛋白和黏蛋白，遇水易膨胀，膨胀度大于55，且粘稠度较大，不利于生产加工和皮肤吸收。采用蛋白酶酶解的方法可以降低哈蟆油蛋白分子量，水溶性好[7]；且双酶法制备哈蟆油蛋白多肽更优于单酶法[8]。董颖等[9]采用双酶法制备的哈蟆油蛋白多肽，仅从酶解前后分子量分布情况进行比较，而酶解前后粘度的改变也是考察的重要指标之一[10]。因此本研究在董颖等的研究基础上，采用双酶法制备哈蟆油蛋白多肽，根据分子量和粘度的变化对其进行评价；应用体外离体试验，研究哈蟆油蛋白多肽的透皮吸收情况，为哈蟆油化妆品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

林蛙：蛟河市前进乡；碱性蛋白酶、胃蛋白酶：北京鼎国生物技术有限责任公司；标准分子量蛋白(Mr 6.5 kDa，Mr 13.7 kDa，Mr 29 kDa，Mr 43 kDa，Mr 75 kDa)：GE Healthcare；血管活性肠肽(Mr 3.323 kDa)：美仑生物技术有限公司；多肽(GLLGASVLGL，Mr 0.899 kDa)：中肽生化有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸钠：美国Fluka公司；Zenix SEC-100色谱柱，美国Sepax公司。SPF级昆明小鼠，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。试验在长春中医药大学吉林省中药生物大分子重点实验室，于20013年2—11月份进行。

1.2 主要仪器

Aglient1100 HPLC色谱仪：美国Aglient公司；RYH-6B透皮吸收仪：天津市光学仪器厂；AB135-S分析天平，PHS-25数显酸度计：梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津；WFO烘箱：上海爱郎仪器有限公司；DV-Ⅱ+P型旋转黏度计，美国BROOKFIELD公司。

1.3 哈蟆油蛋白多肽制备及黏度测定

采用双酶法制备哈蟆油蛋白多肽[9]，取哈蟆油20 g，按料液比1:100加入pH 4.5的柠檬酸2 L，浸泡36 h，样品浓度1.0 g/100 mL，室温条件下应用旋转粘度计测定其黏度，记录黏度值（浸提液）；匀浆后加入4 L蒸馏水，煎煮2 h，浓缩，样品浓度3.8 g/100 mL，冷却至室温测定黏度值（水煮液）；用2 mol/L HCl调节pH 2.0～3.0，按酶与底物比1:2000加入胃蛋白酶10.0 mg，37℃酶解2 h，酶解后样品煮沸15 min，使酶失活，样品浓度3.8 g/100 mL，冷却至室温测定黏度值（胃蛋白酶酶解液）；用1 mol/L NaOH调节至pH 9.0～10.0，按酶与底物比1:100加入碱性蛋白酶200.0 mg，55℃酶解6 h，酶解后样品煮沸15 min，使酶失活，样品浓度7.0 g/100 mL，冷却至室温测定黏度值（碱性蛋白酶酶解液）；调pH 6.8～7.2，0.22 μm滤膜过滤，上清液冻干，冻干粉即为哈蟆油蛋白多肽。

1.4 哈蟆油蛋白相对分子质量测定

1.4.1 高效液相色谱条件 色谱柱为Zenix SEC-100；流动 相 为 0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L NaH2PO4，0.1 mol/L Na2SO4，pH 6.4；流速 1 mL/min；进样量20 μL；检测波长230 nm。

1.4.2 分子量标准曲线 不同分子质量标准蛋白（Mr 0.899 kDa，Mr 3.323 kDa，Mr 6.5 kDa，Mr 13.7 kDa，Mr 43 kDa，Mr 75 kDa）溶于pH 6.4的流动相，按高效液相色谱条件进样。以分子质量的对数(log Mr)为横坐标(x)，保留时间(min)为纵坐标(y)，绘制标准曲线，见公式(1)。

1.4.3 样品测定 取酶解前和酶解后样品，0.22 μm滤膜过滤，取20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱峰的保留时间和峰面积百分比，根据标准曲线计算样品相对分子质量。

1.5 哈蟆油蛋白多肽透皮率测定

1.5.1 皮肤制备 Wistar雌性小鼠，将鼠断颈处死后，剪去腹部毛，分离腹部皮肤，去除皮下筋膜和脂肪，用生理盐水反复冲洗，至无浑浊为止，用铝箔包裹后放入-20℃冰箱冷藏备用。

1.5.2 透皮吸收测定 将鼠皮固定在透皮吸收试验装置的扩散室与接受室之间，角质层面向扩散室，在接收室中注入生理盐水接收液6.87 mL，使液面完全与皮肤内层接触，分别在扩散池内分别加2 mL酶解前和酶解后的哈蟆油蛋白溶液(100 mg/mL)，加样平衡30 min后开始计时，开启电磁恒温搅拌器，温度37±2℃，100 r/min恒速搅拌，分别于1、2、4、6、8、10、12、24、30 h和36 h从接收池中取样0.3 mL，同时补加0.3 mL生理盐水并排尽气泡。采用Lowry法测定不同时间透皮液中蛋白多肽含量，按上文色谱条件测定各样品中相对分子质量，根据公式(2)计算透皮率。

式中，Y为透皮率(%)；Cn—第n个取样点测得的蛋白多肽浓度，mg/mL；Ck—第n个取样点前所有取样点相对应测得的蛋白多肽浓度，mg/mL；Vn—接收液体积，mL；Vk——第n个取样点前所有取样点相对应的取样体积，mL；m—原样品中蛋白质的质量，mg。

2 结果

2.1 哈蟆油蛋白多肽相对分子量测定结果

从图1可以看出，哈蟆油蛋白酶解前后主要有2个色谱峰，5.015 min和10.812 min，相对应的分子质量分别为1147 kDa和6.8 kDa。分子质量为1147 kDa的色谱峰峰面积百分比从酶解前的75.36%降到8.83%，而6.8 kDa的色谱峰峰面积百分比从酶解前的14.27%增加到74.49%。双酶法制备的哈蟆油蛋白多肽相对分子质量小于10 kDa约占91%，表明此条件下哈蟆油蛋白已大部分酶解为小分子多肽。

图1 哈蟆油蛋白酶解前后HPLC图

2.2 哈蟆油蛋白多肽黏度分析结果

哈蟆油蛋白多肽粘度测定结果如图2，随着对哈蟆油处理的变化，哈蟆油蛋白多肽提取液浓度增高，哈蟆油蛋白多肽溶液的黏度越低。采用柠檬酸浸泡36 h后哈蟆油黏度最大为5278.85 mPa·s(1.0 g/100 mL)；依次加入胃蛋白酶和碱性蛋白酶后，哈蟆油蛋白的黏度由酶解前2215.09 mPa·s(3.8 g/100 mL)降为酶解后12.56 mPa·s(7.0 g/100 mL)。表明哈蟆油中高分子量的蛋白质在胃蛋白酶-碱性蛋白酶酶解之后相对分子质量降低，黏度也明显降低。

图2 哈蟆油蛋白多肽提取液黏度分析(±s,n=3)

2.3 哈蟆油蛋白透皮吸收分析结果

2.3.1 透皮率结果 透皮率测定结果如图3，随着时间的不断延长，哈蟆油蛋白酶解前后透皮率均不断增加，在相同透皮时间下，酶解后样品透皮率均高于酶解前样品，酶解前样品在6 h时后透皮率趋于平缓，最高为4.50%；酶解后样品在12 h时后透皮率趋于平缓，最高为9.14%，哈蟆油蛋白酶解后多肽比酶解前的蛋白透皮率增加了103.11%。

图3 酶解对哈蟆油蛋白透皮率的影响(±s,n=3)

2.3.2 透皮液中哈蟆油蛋白多肽相对分子量测定结果从图4可以看出，随着透皮时间的增加，各吸收峰峰高明显增加，表明透皮液中哈蟆油蛋白多肽浓度越来越高。从图5结果可以看出，分子量1069 kDa、0.958 kDa和0.165 kDa蛋白多肽的色谱峰随着透皮时间的含量显著增加；7 kDa和2.46 kDa蛋白多肽色谱峰随着透皮时间的增加含量降低；而分子质量2.97 kDa蛋白多肽色谱峰随透皮时间的增加在6 h达到含量最大，之后含量显著降低。透皮时间为36 h时，0.958 kDa蛋白多肽含量最高为39.44%，其次是0.165 kDa蛋白多肽和2.46 kDa蛋白多肽，分别占22.65%和13.34%。

图4 酶解后样品透皮液中哈蟆油蛋白多肽HPLC图

图5 不同透皮时间透皮液中哈蟆油蛋白多肽分子量分布(±s,n=3)

3 讨论

3.1 双酶法法制备哈蟆油蛋白多肽

哈蟆油中含有高分子量的胶原蛋白和高度糖基化的黏蛋白，二者易吸水而膨胀形成不溶于水且黏度很大的水凝胶，通常采用蛋白酶酶解的方法降低黏度和增加水溶性。张梅等[11]比较了碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解后哈蟆油蛋白黏度的变化，结果发现碱性蛋白酶对哈蟆油酶解作用最好，能明显降低其黏度。周光新等[7]采用正交试验优选胰蛋白酶酶解哈蟆油蛋白的工艺，最佳工艺条件为柠檬酸pH 4.5，料液比为1:100(g:mL)，浸提时间为12 h，胰蛋白酶与底物比为1:100(g/g)，酶解时间为12 h，分子量小于5 kDa的蛋白质约占52.73%。刘诗超等[10]采正交实验研究碱性蛋白酶法制备哈蟆油蛋白酶解物，酶用量120 U/g，酶解温度65℃，酶解时间40min，酶解后的哈蟆油由最初黏度3127 mPa·s降为8.86 mPa·s。董颖等[9]采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶双酶法制备哈蟆油蛋白多肽，酶解条件为按酶与底物比1:2000加胃蛋白酶酶解2 h后，加碱性蛋白酶（酶与底物比1:100）酶解6 h，酶解后哈蟆油蛋白多肽分子量小于5 kDa占94.85%。吴恒杰[12]采用正交试验优选哈蟆油酶解的工艺，先后采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和风味酶制备哈蟆油酶解液，得到较高蛋白质水解度的产品。综合上述的研究结果，胃蛋白酶和碱性蛋白酶双酶法为最佳制备哈蟆油蛋白多肽的方法。张梅等[13]考察了影响哈蟆油黏度的主要因素，发现pH偏酸或偏碱、料液比大于1:800(g:mL)、盐浓度高于200 mmol/L和加热时间4 h以上能显著降低哈蟆油黏度，黏度从1300 cp多降低到50 cp。哈蟆油在偏酸或偏碱性条件下发生了水解，高分子量的糖蛋白降解为水溶性的蛋白质；高温水加热时，蛋白质的结构被破坏，使疏水基团暴露在分子表面，包裹在其中的水分子被破坏，随着加热时间的延长，氢键被破坏，哈蟆油蛋白的网状结构被破坏，锁水能力降低[13-14]。本文的实验结果中（图2），水煮后的哈蟆油蛋白分子量仍特别高，主要在1147 kDa左右；然后采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶先后进行酶解，其中胃蛋白酶为一种酸性蛋白酶，最适pH 2～3之间，倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）或亮氨酸的肽键；而碱性蛋白酶的最适pH 9～11之间，它可水解肽键、酰胺键和酯键。从图2可以看出哈蟆油通过两种蛋白酶酶解后，1147 kDa的色谱峰峰面积百分比从酶解前的75.36%降到8.83%，而6800 kDa的色谱峰从酶解前的14.27%增加到74.49%，黏度由酶解前的2215.09 mPa·s降至酶解后12.56 mPa·s。通过热解和酶解后哈蟆油中蛋白质分子断裂，网状结构被破坏，使疏水集团暴露在外，锁水能力减弱，水分子被释放从而使其黏度下降。

3.2 哈蟆油蛋白多肽透皮作用

皮肤分为表皮层和真皮层，一般影响皮肤透过率的主要屏障是位于表皮最外层的角质层，主要因素包括亲脂性、疏水性、水合作用、分子量大小等[15-16]。一般情况下，皮肤是选择性透过分子量小，脂溶性好的成分。Zhang等[17]体外研究胶原蛋白的透皮作用中发现，5～13 kDa的蛋白多肽易透过皮肤，起到保湿和抗氧化的作用。Cooperman和Johnsen[18]报道1～3 kDa的胶原蛋白水解物能透过皮肤或毛囊；进而修复内源性胶原蛋白和弹性蛋白纤维[19,20]。本文的研究结果发现相对分子质量小于1 kDa的蛋白多肽或氨基酸透过率最高，而7～2.46 kDa的蛋白多肽也能透过皮肤（图4和图5），可能是由于哈蟆油蛋白多肽中高含量的带正电荷的精氨酸（含量为14.26%）[21,22]，极性氨基酸（苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）占56.21%和疏水性氨基酸（丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸）占38.72%的氨基酸组成特点[23]，酶解后富含以上氨基酸的蛋白多肽易透过皮肤而被吸收。

4 结论

哈蟆油含有天然活性成分，安全、营养将越来越受到人们的青睐，其产品具有极大的市场潜力。本研究采用胃蛋白酶-碱性蛋白酶双酶制备哈蟆油蛋白多肽，分子量低，黏度小，水溶性好。通过体外透皮实验，分子量小于1 kDa的小分子多肽能透过皮肤，其次是分子量小于2.46 kDa的蛋白多肽，哈蟆油蛋白多肽的透皮率为9.14%。双酶法制备的哈蟆油蛋白多肽易于透过皮肤。本研究为哈蟆油的化妆品开发提供理论基础。