基于多元统计分析的产地制何首乌品质评价研究

姜建辉，张志强，汤丹丹，夏清（四川中医药高等专科学校，四川 绵阳 621000）

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根，中医临床常用何首乌和制何首乌入药。何首乌具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效；制何首乌具有补肝肾、益精血、乌须发和强筋骨的功效。用于血虚萎黄，眩晕耳鸣，须发早白，腰膝酸软，肢体麻木，崩漏带下和久疟体虚等[1]。现代药理研究表明，何首乌具有多种药理活性[2]，如抗衰老[3]、增强免疫能力[4]、抗肿瘤[5]和抗抑郁[6]等。《中国药典》2015年版收载了乙肝宁颗粒、七宝美髯颗粒等59 种含何首乌和制何首乌的单方或成方制剂[7]，临床使用量较大。

川产何首乌的记载始于清·雍正《叙州府志》：“药材有何首乌”[8]。现今何首乌在四川的分布更为广泛，品种优良，产量宏丰，是川产道地药材之一[9]。金堂、雅安、泸州、乐山、凉山州和遂宁等地是四川何首乌的主要产区。在对川产何首乌质量的相关文献报道中，对制何首乌的质量评价鲜有报道，对何首乌的质量评价较多，其中二苯乙烯苷类指标成分的含量差异甚大，如邢加慧等[10]测得四川何首乌中二苯乙烯苷含量为3.92%，而沈亚芬等[11]测得四川何首乌中二苯乙烯苷含量仅为0.101%，未达到药典标准（二苯乙烯苷含量不少于1%）。

本课题组前期已采集四川金堂、遂宁、雅安、乐山和西昌5 个不同产地的何首乌药材，同时以二苯乙烯苷和游离蒽醌为指标成分，对何首乌生品质量进行科学、客观的评价。为了更加合理评价川产制何首乌质量，完善川产道地药材生产区划，本课题拟在前期研究基础上，按照《中国药典》（2015年版）制何首乌项下以黑豆汁拌匀后蒸法炮制5 个不同产地的何首乌，并采用主成分分析（PCA）和TOPSIS 分析法对制何首乌中二苯乙烯苷、游离蒽醌、灰分和醇溶性浸出物等指标进行较为全面的评价。

1 材料

1.1 仪器

DGU-20A 岛津液相色谱仪（日本岛津公司）；ATY124 万分之一电子天平（日本岛津公司）；SX2-9-12TP 马氟炉（上海超泓仪器设备有限公司）。

1.2 试药

对照品二苯乙烯苷（批号：T110192，纯度≥98.0%）、大黄素（批号：E106693，纯度≥98.0%）、大黄素甲醚（批号：P111308，纯度≥98.0%）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；色谱乙腈（德国默克股份有限公司）；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

何首乌药材来源见表1，经四川中医药高等专科学校药用植物教研室任劲松老师鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根。参照《中国药典》2015年版中的方法对四川5 个产地的何首乌进行炮制，得制何首乌。

表1 药材来源Tab 1 Source of medicinal materials

2 方法与结果

2.1 二苯乙烯苷、游离蒽醌含量测定

2.1.1 色谱条件 在朱培芳等[12]的方法基础上进行改进，色谱柱：Wondasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（见表2）；检测波长：254 nm；流速：1 mL·min－1；柱温：30 ℃；进样量：20 µL。二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚及供试品溶液的HPLC 图见图1。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）的HPLC 图Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference（A）and sample（B）

表2 梯度洗脱表Tab 2 Gradient elution

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取二苯乙烯苷对照品10.01 mg、大黄素对照品4.61 mg 和大黄素甲醚对照品4.38 mg，甲醇定容，制成质量 浓 度 分 别 为400.35、61.47 和29.2 µg·mL－1的储备液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 分别取制何首乌粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品储备液适量配制成系列混合对照品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得线性回归方程、相关系数和线性范围。逐级稀释混合对照品母液，按信噪比（S/N）＝10 计算定量限，结果见表3。

表3 线性关系和定量限Tab 3 Linearity and limit of quantitation

2.1.5 精密度试验 取适量二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续测定6 次，计算得二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为3.4%、0.90%和2.6%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取西昌制何首乌，按“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，计算得二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚含量的RSD分别为4.1%、0.80%和1.6%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取西昌制何首乌，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别于1、3、5、7、12、24 h 进样，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，计算得二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为4.3%、1.0%和1.8%，表明样品在24 h 内稳定性良好。

2.1.8 加样回收试验 精密称取已知含量的西昌制何首乌0.25 g，加入相当于样品中3种成分含量80%、100%、120%的对照品，各3 份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，计算加样回收率。二苯乙烯苷低、中、高浓度的平均加样回收率分别为96.5%、101.3%和97.7%，RSD值分别为2.7%、2.9%和3.1%；大黄素低、中、高浓度的平均加样回收率分别为97.7%、95.3%和102.7%，RSD值分别为1.5%、3.5%和2.2%；大黄素甲醚低、中、高浓度的平均加样回收率分别为96.8%、99.7%和95.7%，RSD值分别为1.6%、2.1%和2.0%。

2.1.9 样品含量测定 取不同产地制何首乌粉末，按“2.1.3”项下方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，用外标法计算二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量。

2.2 灰分的测定

灰分的测定方法按《中国药典》2015年版第四部（通则2302）项下[1]收载的方法进行。按公式（1）计算供试品中总灰分的百分含量，按公式（2）计算供试品中酸不溶性灰分的含量（%），按公式（3）计算供试品中生理灰分的含量（%）。

2.3 醇浸出物的测定

醇浸出物的测定方法按《中国药典》2015年版第四部（通则2201）项下[1]收载的方法进行。除另有规定外，以干燥品按公式（4）计算供试品中醇浸出物的含量（%）。

3 结果与分析

3.1 制何首乌中二苯乙烯苷、游离蒽醌、灰分和醇浸出物的含量

川产制何首乌中二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、灰分和醇浸出物的测定结果见表4。二苯乙烯苷的含量为0.63%～3.67%，大黄素含量为0.14%～0.23%，大黄素甲醚含量为 0.13%～0.17%，游离蒽醌的含量为0.30%～0.36%。不同产地制何首乌中二苯乙烯苷的含量差异较大，而游离蒽醌的含量相当。总灰分的含量为1.88%～4.46%，酸不溶性灰分为0.12%～0.47%，生理灰分为1.75%～4.05%。醇浸出物的含量为1.72%～11.85%。不同产地的制何首乌醇浸出物含量差异较大。

表4 不同产地制何首乌中二苯乙烯、游离蒽醌、灰分和醇浸出物的二含量测定结果(%，±s，n ＝3)Tab 4 Content of stilbene glycosides，free anthraquinone (based on the total amount of emodin and emodin methyl mther)，ash content and extract of Polygoni Multiflori Radix Praeparata (%，±s，n ＝3)

表4 不同产地制何首乌中二苯乙烯、游离蒽醌、灰分和醇浸出物的二含量测定结果(%，±s，n ＝3)Tab 4 Content of stilbene glycosides，free anthraquinone (based on the total amount of emodin and emodin methyl mther)，ash content and extract of Polygoni Multiflori Radix Praeparata (%，±s，n ＝3)

注：不同产地间两两比较，不同的字母表示差异有统计学意义（P ＜0.05）。Note：Different letters indicate that the difference between different origins by pairwise comparisons is statistically significant（P ＜0.05）.

编号 产地 二苯乙烯苷 游离蒽醌 总灰分 酸不溶性灰分 生理灰分 醇浸出物大黄素 大黄素甲醚12345金堂西昌雅安乐山遂宁2.71±0.09b 3.67±0.05a 0.65±0.05d 0.63±0.04d 1.66±0.06c 0.18±0.01a 0.23±0.01a 0.14±0.02a 0.15±0.01a 0.22±0.02a 0.15±0.01a 0.13±0.01a 0.15±0.01a 0.17±0.01a 0.13±0.01a 3.04±0.04c 3.76±0.02 b 4.46±0.01 a 1.88±0.02d 3.03±0.04c 0.15±0.01c 0.26±0.02b 0.47±0.01a 0.12±0.01c 0.26±0.01b 2.85±0.03c 3.51±0.04b 4.05±0.12a 1.75±0.04d 2.76±0.01c 6.26±0.12b 11.85±0.23a 4.29±0.04c 1.72±0.02d 4.28±0.06c

3.2 PCA

应用 SPSS 21.0 统计软件对制何首乌的成分测定结果进行主成分分析[11]，分析结果如表5所示。制何首乌中特征值＞1 的主成分有两个，其累积方差贡献率达94.985%，基本可以客观反映制何首乌的样本信息。总灰分和生理灰分在第一主成分有较高载荷，表明第一主成分基本可以反映这两个成分的信息，成高度正相关；游离蒽醌在第二主成分有较高载荷，表明第二主成分基本反映了游离蒽醌的信息，成高度正相关。据得分系数矩阵结果，何首乌各主成分得分模型为F1＝0.5308X1＋0.404X2＋0.5375X3＋0.4198X4＋0.2812X5＋0.1048X6，F2＝－0.2073X1－0.4124X2－0.1835X3＋0.399X4＋0.528X5＋0.5618X6，综合得分模型为F＝0.200 65X1＋0.038 96X2＋0.215X3＋0.4105X4＋0.391 59X5＋0.309 22X6；根据主成分综合模型以标准化后的数据计算综合主成分值，并对其按综合主成分值进行排序[13]：西昌（1.8045）＞金堂（0.1841）＞遂宁（－0.07404）＞雅安（－0.3409）＞乐山（－1.5736），表明西昌制何首乌质量最佳。

表5 制何首乌中主成分分析结果Tab 5 Principal component analysis of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

3.3 TOPSIS 分析

根据各指标成分权重结果，以标准化数据采用DPS 软件进行TOPSIS 分析，按得分进行排名，结果见表6。西昌（0.7261）＞金堂（0.5722）＞乐山（0.3343）＞遂宁（0.2948）＞雅安（0.1503），表明西昌的制何首乌质量最优。

表6 制何首乌TOPSIS 评价的结果Tab 6 TOPSIS of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

4 讨论

本研究对四川5 个产地的制何首乌中灰分、醇浸物、二苯乙烯苷和游离蒽醌进行测定。采用高效液相色谱法同时测定3 种成分的含量，操作简单、准确可靠，具有良好的精密度、稳定性和重复性，可为制何首乌的全面品质评价提供有效的方法。

多元统计分析能更全面、更准确地控制中药的质量，在中药资源的质量评价、成分浅析、真伪鉴别等方面运用广泛。主要使用的方法有主成分分析、因子分析、聚类分析等[14]。本研究采用PCA 和TOPSIS 分析法对测定指标进行评价。主成分分析和 TOPSIS 分析得到各地制何首乌的质量评价排名有差异，但对于排名靠前的样品，两种方法得到一致的结果：西昌最优，金堂次之。可见，PCA 和 TOPSIS 分析法对产地影响较大的数据分析可得到基本一致的排名结果。