基于微流控芯片的复方木鸡颗粒诱导HepG2细胞凋亡作用研究

孙悦，包永睿，2，3，王帅，2，3，李天娇，2，3，孟宪生，2，3*（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 6600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600）

目前，微流控芯片技术在药物研发领域中发展迅速，凭借其高通量、低消耗等优势成为21 世纪分析科学及生命科学等众多领域的研究热点[1]。肝癌因其发病隐匿、致死率高，成为目前对人类健康和生命威胁极大的恶性肿瘤之一[2]。虽然手术治疗、放疗、化疗等都有一定效果，但肝癌患者5年的生存率仍不足20%，且复发率极高，因此寻找有效的抗肝癌药物迫在眉睫。作为传统满药第一方——复方木鸡颗粒是由云芝提取物、核桃楸皮、山豆根、菟丝子4味中药组成。云芝性甘、平，入心、脾、肝、肾经，具有健脾利湿、清热解毒的功效，常用于湿热黄疸、胁痛、纳差、倦怠乏力等[3]，现代研究[4]表明其具有较好的增强免疫、抗肿瘤等药理作用，为该方君药；辅以具有清热解毒作用的山豆根、核桃楸皮，以及具有补肝益肾作用的菟丝子共同发挥抗肝炎、肝硬化、肝癌等药理作用。根据文献调研[5-6]及前期课题组[7]研究发现，复方木鸡颗粒具有诱导肝癌细胞凋亡的作用，但其各组分药效作用尚不明确，故本实验将微流控芯片技术与中药复方相结合，针对中药复方药效筛选复杂又繁琐的问题，构建一种多功能的高通量药物筛选芯片，并考察芯片的适用性；同时利用该芯片开展复方木鸡颗粒及其各组分诱导肝癌HepG2 细胞凋亡作用研究。

1 材料

1.1 细胞株

人肝癌HepG2 细胞购于齐氏（上海）生物科技有限公司。

1.2 试药

复方木鸡颗粒（规格：10 g/袋，批号：18080224），核桃楸皮、菟丝子、山豆根、云芝药材由丹东药业提供，均经辽宁中医药大学药用植物教研室许亮教授鉴定，分别为胡桃科植物核桃楸Juglans mandshuricaMaxim.的干燥树皮、菟丝子亚科植物菟丝子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟种子、豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根茎、多孔菌科真菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor（L.ex Fr.）Quel 的干燥子实体。

紫杉醇注射液（山西普德药业股份有限公司）；负性环氧树脂光刻胶SU-8 及显影液（美国Micro-Chem 公司）；Sylgard 184 型聚二甲基硅氧烷PDMS 及固化剂（美国Dow-Corning 公司）；达尔伯克改良伊格尔氏培养基DMEM、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（美国GIBCO 公司）；细胞凋亡/坏死检测试剂盒[含Hoechst 33342 染液和碘化丙啶（PI），碧云天生物技术研究所]；细胞死活检测试剂盒（钙黄素Calcein-AM/PI，北京索莱宝科技有限公司）；青、链霉素混合溶液（美国Hyclone 公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 仪器

LSP04-1A 型精密注射泵（保定兰格公司）；NIKON ECLIPSE TI 荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；TG-2U 型光刻机（北京中科同志科技有限公司）；HPDC-32G-2 型等离子清洗机（Harrick Plasma 公司）；SC-1B 型匀胶机、BP-2B 型烘胶台（北京创世威纳科技有限公司）；W2001R 型CO2培养箱（美国SIM 公司）。

2 方法

2.1 复方木鸡颗粒各组分的制备

2.1.1 核桃楸皮黄酮 取适量核桃楸皮药材粉末，以15 倍生药量的60%乙醇加热回流提取2次，每次1 h，合并2 次滤液，水浴加热浓缩至0.1 g·mL－1生药浓度，以等体积的AB-8 湿树脂进行纯化，2 倍柱体积三级水除杂，再用12 倍柱体积60%乙醇洗脱，洗脱液重复上述纯化方法进行二次纯化，二次洗脱液水浴加热浓缩至近干，减压干燥，即得[8]。

2.1.2 菟丝子黄酮 取适量菟丝子药材粉末，以15 倍生药量的95%乙醇加热回流提取3 次，每次1.5 h，合并3 次滤液，水浴加热浓缩至0.1 g·mL－1生药浓度，将浓缩液pH 调至5，以1.1倍体积的HPD-400 湿树脂进行纯化，2 倍柱体积三级水除杂，再用4 倍柱体积60%乙醇洗脱，洗脱液水浴加热浓缩至近干，减压干燥，即得[9-10]。

2.1.3 山豆根生物碱 取适量山豆根药材粉末，以10 倍生药量的65%乙醇加热回流提取2 次，每次2 h，合并2 次滤液，水浴加热浓缩至0.8 g·mL－1生药浓度，将浓缩液pH 调至5，以0.8 倍体积的HPD-300湿树脂进行纯化，2倍柱体积三级水除杂，再用8 倍柱体积65%乙醇进行洗脱，二次洗脱液水浴加热浓缩至近干，减压干燥，即得[11]。

2.1.4 菟丝子多糖 取适量菟丝子药材粉末，以20 倍生药量的三级水加热回流提取2 次，每次1 h，合并2 次滤液，水浴加热浓缩至0.5 g·mL－1生药浓度，加入过量80%乙醇混匀，静置醇沉24 h，滤过后水溶除杂，加热稍浓缩后涂于高温清洁灭菌处理过的搪瓷托盘内壁，置入真空干燥装置内常温干燥。

2.1.5 山豆根多糖 取适量山豆根药材粉末，以10 倍生药量三级水加热回流提取3 次，每次1 h，合并3 次滤液，水浴加热浓缩至1.0 g·mL－1生药浓度，加入过量75%乙醇混匀，静置醇沉12 h，同“2.1.4”项下方法进行除杂和干燥[12]。

2.1.6 云芝多糖 取适量云芝药材粉末，以30倍生药量三级水加热回流提取3 次，每次2 h，合并3 次滤液，水浴加热浓缩至1.0 g·mL－1生药浓度，加入过量70%乙醇混匀，静置醇沉24 h，同“2.1.4”项下方法进行除杂和干燥。

上述提取纯化方法是在本课题组前期大量文献调研以及实验得出的制备方法的基础上进一步优化而得，按照上述方法制备6 个组分，获得相应组分的干膏，密封后置于干燥器中保存。

2.2 溶液的配制

2.2.1 紫杉醇的配制 吸取适量紫杉醇注射液，用DMEM 培养基配制成30 μL·mL－1的溶液，4℃备用。

2.2.2 细胞含药培养液的配制 称取适量复方木鸡颗粒及上述6 个组分纯化物，分别配制成质量浓度为6 mg·mL－1和1 mg·mL－1的细胞含药培养液，过0.22 µm 微孔滤膜，所得药液作为储备液。

2.3 芯片的设计与制作

本实验构建一种多功能的高通量药物筛选芯片，分为上下两部分，依次为PDMS 流体通道层和玻璃基片层，如图1所示。主要通道为流体通道，包括流体通道区和细胞培养区，长5.5 cm，宽2.5 cm，其厚度约3 mm，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l 为12个细胞及药物入口，o 为废液出口；本实验将a、b、c、d、e、f、g、h 作为给药的8 个入口，i、j、k、l 用作细胞培养及活力检测实验的入口，o 为共用废液口；细胞培养区由6×6 列培养通道组成，每条通道设有4 个复孔，培养腔为椭圆形，尺寸为1.0 mm×1.2 mm。

图1 微流控芯片示意图Fig 1 Schematic diagram of microfluidic chip

芯片采用实验室微流控技术，通过软光刻、模塑法以及氧等离子体键合三大技术手段制得[13-14]。该芯片可实现细胞培养、药物及组分配伍、药物对细胞刺激、结果生成与检测等多种功能。实物图如图2所示。

图2 微流控芯片实物图Fig 2 Physical diagram of microfluidic chip

2.4 芯片预处理

将芯片的流体通道层先用75%乙醇清洗3遍，再通入纯水清洗3 遍，烘干，置于超净工作台紫外照射30 min 后即可使用。

2.5 芯片中细胞培养及活力检测

取HepG2 细胞，使用DMEM 培养液（10%胎牛血清、1%的青链霉素混合溶液）于细胞培养箱中（37℃、5% CO2、饱和湿度）常规培养，待细胞处于对数生长期时，将细胞密度调整为5×105个·cm－2，接种于芯片中，待细胞贴壁后，将培养液以0.2 μL·min－1的流速经微量注射泵注入芯片中进行动态培养。同时，将HepG2 细胞在微流控芯片中分别培养24、48、72 h 后，用细胞检测死活试剂盒对细胞进行染色，检测HepG2细胞的活力，计算芯片中细胞的存活率，细胞存活率（%）＝活细胞数/（活细胞数＋死细胞数）×100%。

2.6 芯片中复方木鸡颗粒及其各组分对HepG2细胞的促凋亡坏死作用

待芯片中细胞密度在80%左右时，用精密注射泵以0.2 μL·min－1的速度进行给药刺激，当不同组分药液分别作用HepG2 细胞24、48 和72 h 后，停止给药，用微量注射器吸取一定量的PBS，缓慢注入细胞培养通道内对细胞进行清洗后，从培养液入口处以0.2 μL·min－1的流速通入Hoechst 33342 和PI 染液进行双染，使用荧光倒置显微镜拍照，并运用IPP（Image-Pro Plus 6.0）图像分析软件对图像进行处理分析，计算细胞凋亡坏死率，检测不同组分的药效差异，细胞凋亡坏死率（%）＝（凋亡细胞数＋坏死细胞数）/细胞总数×100%。

2.7 数据分析

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析，所有数据均用（±s）表示，组间比较采用单因素方差。P＜0.05 代表差异有统计学意义。

3 结果

3.1 芯片中HepG2 细胞生长状态及细胞活力

按照“2.5”项下方法培养细胞，结果发现，HepG2 细胞在芯片细胞培养腔中培养4 h 后基本贴壁，24、48、72 h 后通过荧光倒置显微镜观察发现，细胞完全伸展，胞质透明，形态正常，如图3所示。细胞在芯片中的生长状态良好，细胞存活率均在96%以上，如图4所示。

图3 显微镜下不同时间点空白组细胞生长状态（10×）Fig 3 Cell growth states of blank group at different time points（10×）

图4 不同时间点空白组细胞死活检测试剂盒双染荧光图片Fig 4 Live/Dead double-stained fluorescence images of cells in blank group at different time points

3.2 复方木鸡颗粒及其各组分对HepG2 细胞的促凋亡坏死作用

复方木鸡颗粒及其各组分同时对细胞进行24、48 和72 h 的刺激，用Hoechst 33342/PI 对细胞进行双染。结果见表1及图5。

表1 复方木鸡颗粒及其各组分对HepG2 细胞凋亡坏死率的影响(±s，n ＝4，%)Tab 1 Effect of Fufang Muji granules and their active components on apoptosis and necrosis rate of HepG2 cells (±s，n ＝4，%)

表1 复方木鸡颗粒及其各组分对HepG2 细胞凋亡坏死率的影响(±s，n ＝4，%)Tab 1 Effect of Fufang Muji granules and their active components on apoptosis and necrosis rate of HepG2 cells (±s，n ＝4，%)

注：与空白组比较，*P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05.

组别 时间24 h 48 h 72 h空白组 1.15±0.26 1.13±0.23 1.36±0.34紫杉醇 43.36±0.55* 58.07±0.35* 74.25±0.23*复方木鸡颗粒 33.04±0.78* 56.58±0.65* 70.25±0.88*核桃楸皮黄酮 52.84±1.17* 74.13±0.57* 89.82±0.87*菟丝子黄酮 38.45±0.47* 55.03±1.60* 68.21±1.07*山豆根生物碱 29.02±1.23* 42.54±0.57* 58.24±0.37*菟丝子多糖 1.52±0.25 2.26±0.19 3.24±0.36山豆根多糖 1.26±0.42 2.93±0.22 3.53±0.35云芝多糖 1.99±0.39 2.50±0.53 2.86±0.19

图5 6 个组分作用于HepG2 细胞48 h 后的Hoechst 33342/PI 双染荧光图Fig 5 Hoechst 33342/PI Kit double-stained fluorescence of HepG2 cells treated with 6 active components for 48 h

结果表明，刺激48 h 时，复方木鸡颗粒组分中，对细胞的凋亡坏死率较高的为核桃楸皮黄酮、菟丝子黄酮和山豆根生物碱，其中核桃楸皮黄酮的药效优于菟丝子黄酮；山豆根生物碱的药效次之于两种黄酮类成分，这3 种组分对细胞的凋亡坏死率与空白组相比差异均有统计学意义。而方中的另外3 组多糖类成分的药效则相对较差，其对细胞凋亡坏死率均小于3%。

4 讨论

随着显微荧光影像、图像分析处理等技术的不断进步与发展，微流控芯片技术在抗肿瘤类药物筛选领域将拥有巨大的发展前景[15]。微流控芯片技术的优势在于可克服传统96 孔板技术操作繁琐、重复性差以及人为误差较大等实际问题，实现了在微尺度反应室内的动态培养，更加贴近细胞的微生理环境。此外，用蠕动泵以流速0.2 μL·min－1进行动态灌注，作用48 h 后的药液消耗量还不足0.6 mL，大大减少了药液的消耗[16]。芯片流体通道共用一个废液口，这样大大降低了操作难度，且每列细胞培养腔都设计了弯曲的流阻结构，这样的设计可保证液体不倒流，实现不同浓度或不同组分药液的同时给药刺激，既能减小实验误差，也能节约实验时间[17]。本实验设计的芯片可实现12 种药物的同时在线筛选，即药物的高通量筛选，若想筛选更多组分药效，也可通过增加更多的细胞培养区结构单元来实现，该类芯片尤其适用于中药复方的药效筛选。简而言之，微流控芯片用于高通量的药物筛选具有一定的应用优势及开发价值。

本实验基于一种多功能的高通量药物筛选芯片，采用Hoechst 33342/PI 双染法探讨复方木鸡颗粒及其各组分给药24、48 和72 h 后对HepG2细胞的凋亡影响。而选用该染色方法的依据是该法在荧光显微镜下观察效果较Annelid V-FITC/PI好，且易操作、结果稳定可靠、重复性较好。由研究结果得知，除多糖类之外的3 个组分均具有较好的诱导HepG2 细胞凋亡的药理活性，核桃楸皮黄酮和菟丝子黄酮的药效与紫杉醇无显著性差异，说明其促肿瘤细胞凋亡的能力较强，山豆根生物碱也具有较好的凋亡坏死率。通过本实验验证以及文献调研[18-20]，多糖类组分并不是通过直接性杀伤或诱导肿瘤细胞发生自我凋亡来发挥抗肿瘤作用，其本身不具有抗肿瘤活性，是通过增强免疫细胞增殖活性以及调节或促进细胞因子的分泌，作为协同或增效作用成分存在于配方中。

综上所述，本实验基于微流控芯片技术，将复方木鸡颗粒整体拆分成不同组分，探讨各组分的抗肝肿瘤药效作用，揭示了复方木鸡颗粒可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来达到治疗肿瘤的作用。本研究不仅为多组分中药复方药效筛选提供一种方便快捷的实验方法，也为抗肿瘤中药新药研发提供了一定的参考价值。