基于谱效关系探究复方丹参滴丸抗血小板聚集活性的酚酸类物质基础

张丽丽，孙巍，顾小盼，王萍，张磊，张莉华，章顺楠，叶正良*（1.天津中医药大学研究生院，天津 01617；.天士力医药集团股份有限公司，天津 00410；.天士力医药集团股份有限公司，中药先进制造技术国家地方联合工程实验室，天津 00410）

复方丹参滴丸（compound danshen dripping pills，CDDP）主要由丹参、三七的水提取物及冰片组成。具有活血化瘀，理气止痛的功效[1-2]。近年来，基于心肌、血管及血液等方面对其进行了广泛研究[3-5]，确认了其能有效治疗冠心病、心绞痛、糖尿病、高血压等疾病[6-8]。其中抗血小板聚集药效活性作为防治心血管疾病药物的重要指标，一直是研究热点[9-10]。

中药及其制剂的多组分、多靶点、多通路特点及体内复杂代谢过程使得中药质量控制一直是中药国际化的难题。多年来，“找成分，测含量”作为常规的理化检测手段应用于中药质量控制，然而量而不准、难控难评、难关药效等系列问题仍比较突出[11]，为保证中药的内在质量及其安全性和有效性，FDA 于2004年发布的《植物药研发指导原则》也提出了明确的指导意见及开发要求[12]。单一成分含量与整体效价活性联合并重，才能更好地把控中药及其制剂的质量，因此，谱效学研究应运而生，成为了中药质控的重要手段。经文献报道，临床药理均已验证了CDDP、丹参及三七药材的抗血小板聚集药效活性[13-14]。但CDDP抗血小板聚集药效活性与各成分相关性尚未见文献报道。CDDP 的主要成分为丹参中的多酚酸和三七中的多皂苷，两者成分理化性质差距较大，很难用一张色谱图将其全部成分展示清楚[15]，基于此，本研究初步建立了CDDP 稳定性样品多酚酸指纹图谱，利用谱效关系分析方法，对CDDP抗血小板聚集药效活性酚酸类物质基础进行研究，为CDDP“量-效”关系提供研究依据。

1 材料

1.1 CDDP 受试样品

CDDP 受试样品均由天津天士力医药集团股份有限公司提供。随机抽取一批零时CDDP 样品（批号：20190303），分装成11 份，其中5 份在常温贮存条件下（20℃，50%RH）分别贮存0、3、6、9、12 个月，剩余6 份在高温加速条件下（30℃，65%RH）分别贮存1、2、3、6、9、12个月，将贮存后的11 批稳定性样品作为本研究考察样本，样本编号为S1～S11。

1.2 仪器与试药

Waters Acquity UPLCTM液相色谱仪-串联紫外检测器（美国Waters 公司）；Chrono-Log 700-4 血小板聚集分析仪（北京世帝科学仪器有限公司）；LDZ5-2 低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂）；XP205 电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；丹酚酸U（规格：20 mg/瓶，质量分数：93.49%，批号：20151105）、丹酚酸T（规格：20 mg/瓶，质量分数：93.66%，批号：20151106）、迷迭香酸（规格：20 mg/瓶，质量分数：99.0%，批号：BCBN6363V）、丹酚酸B（规格：20 mg/瓶，质量分数：92.24%，批号：20151110）、丹酚酸A（规格：20 mg/瓶，质量分数：96.26%，批号：20151111）、丹参素钠（规格：20 mg/瓶，质量分数：97.75%，批号：20151112）、原儿茶醛（规格：20 mg/瓶，质量分数：92.24%，批号：20151113）（天士力医药集团股份有限公司中药所）；二磷酸腺苷（ADP，批号：3490，美国Chrono-Log 公司）；柠檬酸钠（分析纯，批号：20130815，天津市风船化学试剂科技有限公司）；0.9%氯化钠注射液（批号：1907312009，石家庄四药有限公司）。

1.3 实验动物

SPF 级雌性日本大耳白兔，2.0～2.2 kg [北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK（京）2015-0005]。

2 方法与结果

2.1 CDDP 多酚酸指纹图谱的建立

2.1.1 UPLC 色谱条件 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）。流动相：0.05 mol·mL－1磷酸水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脱：0～1.6 min，18%B；1.6～1.8 min，18%～20.8%B；1.8～6.1 min，20.8%～25%B；6.1～8.0 min，25%～35%B；8.0～8.5 min，35%～90%B；8.5～10.5 min，90%B；10.5～11.0 min，90%～7%B；11.0～12.0 min，7%B。流速：0.4 mL·min－1；柱温：40℃；检测波长：280 nm。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 分别称取适量丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸U、丹酚酸T、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 对照品，加入适量75%甲醇，摇匀，定容至100 mL 量瓶中，均制成质量浓度约为0.1 mg·mL－1的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取复方丹参滴丸0.25 g，精密称定，置10 mL 量瓶中，加纯化水约5 mL 超声15 min，溶解，定容，过0.22 µm水膜，即得。

2.1.4 指纹图谱的建立与分析 精密吸取2 µL对照品及供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，得11 批CDDP 稳定性样品UPLC 多酚酸指纹图谱，见图1；标准对照品图谱见图2。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件对11 批CDDP 稳定性样品色谱峰进行相似度评价，结果11 批稳定性样品相似度均大于0.99，详见表1。11 批稳定性样品通过色谱峰比对，共指认出10 个共有峰，经与混合对照品比对和文献查询，确认峰1～5，峰8～10 分别为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸U、丹酚酸T、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A[16]，峰6、7 代表成分有待进一步探究。以峰1 为参照峰，各色谱峰相对峰面积见表2。

表1 11 批CDDP 稳定性样品相似度评价结果Tab 1 Similarity evaluation of 11 batches of CDDP stability samples

表2 11 批CDDP 稳定性样品HPLC 指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积Tab 2 Relative retention time and relative peak area of the common peaks in the HPLC fingerprints of 11 batches of CDDP stability samples

图1 11 批CDDP 稳定性样品HPLC 多酚酸指纹图谱Fig 1 HPLC polyphenolic acid fingerprint chromatogram of 11 batches of CDDP stability samples

图2 混合对照品UPLC 图Fig 2 UPLC chromatogram of mixed reference substance

2.2 CDDP 抗血小板聚集活性探究

2.2.1 待测血浆的制备 用3%戊巴比妥钠对禁食16 h 以上的日本大耳白兔耳缘静脉进行麻醉，麻醉剂量1 mL·kg－1，完全麻醉后进行腹腔主动脉采血，在全血中按9∶1加入3.8%枸橼酸钠抗凝剂，1000 r·min－1离心10 min，吸取上清液，即得待测富血小板血浆（PRP）。将分离完的PRP 以3000 r·min－1离心10 min 后取上清液，即得贫血小板血浆（PPP）。将PRP 和PPP 血浆敞口静置30 min后，上样检测。血浆在4 h 检测完毕。

2.2.2 ADP 溶液的制备 精密称取ADP 粉末2.50 mg，加入0.9%NaCl 溶液3 mL，摇匀待其完全溶解，补加2 mL0.9%NaCl 溶液，即得ADP 储备液（1 mmol·L－1）。取100 µL ADP 储备液分装于塑料EP管中，－80℃条件下储存1年至试剂有效期。取100 µL ADP 储备液加入生理盐水700 µL 混匀即得ADP 工作溶液（125 µmol·L－1）。ADP 工作液遵循现用现配原则。

2.2.3 对照组溶液的制备 称取丹酚酸B（SAB）粉末15 mg，精密称定，置于1 mL 量瓶，加入适量0.9%NaCl 溶液溶解并定容，摇匀即得储备液。用0.9%NaCl 稀释配制成15.0、12.0、9.60、7.65、6.15、4.95、3.90、3.08 mg·mL－1的对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备 称取复方丹参滴丸约1.4 g，精密称定，置于10 mL 量瓶，加入适量0.9%NaCl 溶液震荡溶解且定容，摇匀即得储备液。用0.9%NaCl 稀释配制成154.8、117.0、79.2 mg·mL－13 个浓度，即得供试品溶液。

2.2.5 CDDP 生物效价的测定 将血小板聚集分析仪预热至37℃，取300 µL PPP 进行基线调零，精密吸取274 µL PRP 和20 µL 不同浓度的药液加入反应杯中（空白组用20 µL 0.9%NaCl），放进反应通道孵育 5 min 后，调平基线，加入6 µL ADP 溶液，待各通道均出现最大聚集率后终止测定，记录最大聚集率，计算出抑制率（%），平行测定3 次，以质量浓度为横坐标，抑制率为纵坐标分别绘制出SAB 和CDDP 的量效关系曲线，采用斜率比法求得相对效价值。最终效价结果为3 次测得平均数。结果显示阳性药丹酚酸B 及CDDP 均具有抗血小板聚集药效活性，且在一定质量浓度范围内呈剂量依赖关系，相对效价值结果见表3。

表3 11 批CDDP 稳定性样品抗血小板聚集相对效价值(±s，n ＝3)Tab 3 Relative potency value of antiplatelet aggregation of 11 batches of CCDP stability samples (±s，n ＝3)

表3 11 批CDDP 稳定性样品抗血小板聚集相对效价值(±s，n ＝3)Tab 3 Relative potency value of antiplatelet aggregation of 11 batches of CCDP stability samples (±s，n ＝3)

批次 相对效价 批次 相对效价S1 0.1568±0.007 S7 0.1600±0.007 S2 0.1450±0.009 S8 0.1445±0.001 S3 0.1374±0.002 S9 0.1395±0.022 S4 0.1216±0.009 S10 0.1078±0.002 S5 0.1100±0.007 S11 0.0710±0.030 S6 0.1639±0.011

抑制率（%）＝（空白组聚集率－加药组聚集率）/空白组聚集率×100%

相对效价＝KCDDP/KSAB

其中K为量效关系曲线斜率，CDDP 为复方丹参滴丸，SAB 为丹酚酸B。

2.3 谱效关系分析与物质基础确认

2.3.1 偏最小二乘法（PLS）回归分析 以抗血小板聚集相对效价值（Y）为因变量，共有峰峰面积（X）为自变量，采用SIMCA 14.0 软件对11 批次稳定性样品进行PLS 回归分析，得标准化回归系数（见图3A）与VIP（见图3B），拟合出标准化回归方程为：Y＝－0.07X1＋0.14X2＋0.10X3＋0.05X4＋0.14X5＋0.10X6＋0.11X7＋0.04X8＋0.13X9＋0.05X10，由回归方程可以看出，抗血小板聚集药效活性是由多种成分共同作用的结果。除1 号峰，其他9 个峰的标准化系数均大于零，说明其药效活性与峰面积成正相关，即含量越高，抗血小板聚集药效活性可能越大；1 号峰的标准化系数为负，说明该峰所对应成分含量与药效活性成负相关。

变量投影（VIP）被用于判断单个自变量在解释因变量时的重要性，VIP ＞1 时，自变量对因变量具有重要意义。由图3B 可知，峰5、2、9、7、3 的VIP 值均大于1，且回归系数均为正，说明这些峰所对应的成分与药效活性具有强关联性，即成分含量越高，对抗血小板聚集药效活性贡献越大，对其抗血小板聚集药效活性具有重要意义。

图3 11 批CDDP 稳定性样品PLS 标准化回归系数图（A）和自变量投影（VIP）值（B）Fig 3 PLS standardized regression coefficient（A）and the variable independent projection（VIP）values（B）of 11 batches of CDDP stability samples

2.3.2 Pearson 双变量相关性分析 为了进一步验证分析结果，采用SPSS 23.0 软件对共有峰峰面积与效价活性值进行双变量相关性Pearson 分析，结果见表4。从结果可以看出，峰5、2 代表成分与效价活性成强相关性（r＞0.8；P＜0.05，P＜0.01），峰9、7 代表成分与效价活性成中等相关（0.5 ＜r＜0.8；P＜0.05，P＜0.01）。

表4 11 批CDDP 稳定性样品谱效关系双变量相关性分析Tab 4 Bivariate correlation of spectrum-effect relationship of 11 batches of CDDP stability samples

2.3.3 两种分析方法结果综合分析 通过对两种分析方法结果的综合分析，分析结果基本具有一致性。综合两种分析结果，筛选出VIP＞1且r＞0.8 的重叠峰分别是峰5 和峰2，即丹酚酸D、原儿茶醛，说明这两个成分与抗血小板聚集效价活性具有强相关；峰9、7 代表成分与效价活性成中等相关（0.5 ＜r＜0.8；P＜0.05，P＜0.01），对抗血小板聚集效价活性均有不同程度的贡献率，其余峰没有显著相关性。

3 讨论

本研究建立了CDDP 多酚酸谱效关系分析方法，采用PLS 与双变量相关分析方法对谱效关系进行相互比较与佐证。结果表明多个酚酸类成分都对CDDP 抗血小板聚集活性有所贡献，不同的酚酸成分对药效活性贡献率也不尽相同。其中丹酚酸D、原儿茶醛对其抗血小板聚集效价活性贡献最大，其次是丹酚酸B、峰7 等成分，其他峰代表成分与效价活性暂未显现出显著相关性，有待进一步考察及验证。抗血小板聚集活性是CDDP 治疗心血管疾病众多途径之一，研究中所得出的部分与含量相关的酚酸类成分尚不能代表其整体活性评价成分，因此还需进一步建立不同模型对其生物活性及其相关成分进行多方面考察，健全评价方法，从而多方位评价其生物活性及产品质量。

此外，本实验前期在参考相关文献的基础上还建立了体外抗血小板聚集生物效价检测方法及其标准操作规程，对标准对照品、药液颜色、PRP 血浆浓度、PRP 血浆pH 值、ADP 浓度、血浆离心转速、PRP 血浆稳健性等条件进行了考察，最终确定了最优试验条件[17]。其中标准对照品的选择在植物药生物效价检测中具有重要意义，直接关乎到检测结果的平行性与准确性。最理想的标准对照品应与检测样品同质，且在一定浓度范围内，受试样品可视为标准品的稀释或浓缩物。除此之外，对照品本身也要具备准确、均一、稳定的特点。由于植物药成分的复杂性，目前在生物效价领域，对其标准对照品的选择和制备均具有一定难度[18-19]。本研究相继以阿司匹林、精氨酸阿司匹林、丹酚酸B 作为标准对照品做了考察，最终从溶解度、线性范围、结果稳定性等多角度综合考虑，确定以丹酚酸B 作为本研究的标准对照品。

综上所述，本实验对CDDP 抗血小板聚集活性酚酸类成分的物质基础进行了初步探究，为CDDP 量效关系提供了一定依据。而酚酸类成分主要来自其君药丹参，尚未对三七中多皂苷成分的谱效关系进行研究，因此本研究尚不能代表CDDP 抗血小板聚集活性的全部物质基础情况，更全面的物质基础仍有待进一步探究。