以水通道蛋白microRNA探讨中医外治恶性胸水研究进展

袁菊花，贾立群，娄彦妮，王 贵，郑丽平，邓海燕

(1. 北京市中西医结合医院，北京 100039；2. 中日友好医院，北京 100029)

恶性胸水是恶性肿瘤常见的并发症，主要由于肿瘤累及胸膜或原发胸膜肿瘤导致，临床治疗难度较大，严重影响患者生活质量及预后。中医将其归属于“悬饮”范畴。近年来,中医治疗恶性胸水的应用及研究日趋增多，内服与外用并举。而中医外治法以其简、便、效、廉优势,在临床中运用越来越广泛，但一直缺乏对于其作用机制的科学有力证据。本文通过对中医外治之贴敷形式，通过对恶性胸水形成机制分析，并结合中医治疗之“利水”原则，探讨若通过水通道蛋白(AQPs)为靶点，引入目前应用于论证中医外治的微小RNA(miRNA)芯片技术，可在基因层面更好地揭示中药外治恶性胸水的生物学作用基础,为临床疗效作用通路提供更为科学的依据，为今后的临床和科研提供参考。

1 中医对恶性胸水认识

《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治》对恶性胸腔积液有十分形象的描述，“饮后水流在胁下，咳唾引痛，谓之悬饮”。唐·孙思邈《千金方痰饮第六》提出“五饮说”，其中“游饮，水游在两胁下”，与悬饮相类似。癥瘕、积聚迁延日久，致肝、脾、肾功能失调，终致气滞、血瘀、水停胸胁，若阳气虚衰，气不化津，则阴邪偏盛，水湿不化，实者愈实，故本虚标实，虚实交错，是本病的主要病机特点。吴非泽[1]通过分析近20年相关文献，恶性胸腔积液常见中医证型有脾虚水停证、脾肾阳虚证、瘀水互结证、饮停胸胁证等，治疗以“温阳散结、行气利水”为基本治法，选用具有泻水逐饮、健脾益肾、利水渗湿、温阳化饮、活血化瘀等功效中药，均最终达到抑制水饮形成，清除水饮之目的。

中医外治恶性胸水既可以遵从中医辨证论治的原则,又能避免口服首过效应，特别是对无法口服中医汤剂或消化道反应较重的患者，无疑是最好的选择。所以近年来应用日趋增多。目前中医治疗恶性胸腔积液的外治方法多采用敷贴疗法，其给药途径直接，药力直接透皮吸收，能具有较好临床疗效。例如霍志刚等[2]将消水散(甘遂、桂枝、大戟、干姜、葶苈子、肉桂等)外敷治疗恶性胸腔积液，可提高患者生活质量。其另一项研究还显示消水散外敷联合顺铂胸腔内灌注治疗恶性胸腔积液能够控制积液的生长,改善患者的免疫功能,减轻化疗药物不良反应[3]。贾立群等[4]予抗癌消水膏(牵牛子、桂枝、莪术、冰片等)外敷患侧胸后壁，临床有效率、症状改善率均高于干扰素胸腔注射对照组。王维等[5]将120 例肺癌恶性胸水患者随机分为中药组、顺铂(DDP) 组、重组人5型腺病毒组及联合治疗组，发现重组人5型腺病毒注射液胸腔内灌注联合攻癌利水散外敷对肺癌伴恶性胸水疗效最佳，同时可显著提高患者生活质量。林青等[6]通过采用散结膏外敷联合顺铂胸腔内灌注化疗治疗癌性胸水68例，结果显示治疗组患者的临床疗效、生活质量评分显著优于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05) 。

2 中医外治法与miRNAs的相关性

历来中医研究者一直致力于寻求多种机制将中医理论、病因病机、治则治法、临床疗效等科学化，而miRNAs的日益兴起给了中医研究更好的论证手段。miRNAs即小分子RNA，是一类具有调节作用的约22个核苷酸的非编码RNA。在基因表达调控中，miRNA最大的特点是多个靶基因可以由一个miRNA进行调控，或者一个靶基因由多个miRNA协同调控。通过这两种方式相互结合形成复杂精确的调控网络，极大地增强了调控效率[7]。miRNA补充了RNA水平对靶mRNA分子的调节,也是对RNA次要的中介角色的重要补充。因其对靶基因表达的多重调节，在各项生理病理过程中发挥重要作用，使得其功能及作用机制是近年来分子生物学研究的热门，并且成为目前药物研发的重要方向。miRNAs可存在于身体体液、血液及组织中，并且通过体液及血液的流动，在组织细胞间转移流动，发挥其调节疾病病理、生理的作用。局部的病变可影响全身，全身的病变也可在局部得以体现，这充分体现了中医整体观的理念。目前也有大量的实验研究得以证实miRNA芯片技术用于中医外治研究的可行性。例如Wang等[8]通过针刺治疗自发性高血压大鼠模型，发现miRNAs参与了高血压大鼠对针刺治疗的反应，针刺可对miR-339/Sirt2/NF-κB/FOX01的信号通路起到调节作用。端淑杰[9]通过新风胶囊联合芙蓉膏对RA患者miRNA的基因谱分析研究，发现miR326与RA有一定关系，新风胶囊联合芙蓉膏能明显改善RA患者Th17/Treg信号通路，并通过临床研究进行了进一步验证。Liu等[10]以SAMP8小鼠为衰老模型，通过测序检测电针刺激后CD4 T细胞miRNAs表达的变化, 表明电针有助于维持衰老免疫系统中CD4 T细胞分化的平衡，并进一步证实miR-301a-3p可介导C57BL/6J小鼠CD4 T细胞的分化，参与调节炎症因子的表达。

3 水通道蛋白可作为中医外治恶性胸水miRNA的切入点

近年来通过对恶性胸腔积液的大量研究表明，恶性胸腔积液的形成机制可以与以下几种物质相关：血管生成素-2[11]、白细胞介素(IL)-6[12]、幼稚B细胞[13]、TLR2信号[14]、EGFR-L858R表达[15]、水通道蛋白(aquaporins,AQPs)。其中AQPS是哺乳动物组织中多表达的跨膜水通道，广泛分布于多种器官和组织的特定细胞类型中，在维持细胞体液平衡方面起着重要的作用。AQPs 家族中的 AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5目前研究均显示与恶性胸腔积液具有相关性。

3.1中药外敷最直接的作用途径——AQP1在胸膜上的高表达 AQP1是跨膜水通道蛋白中最重要也是目前研究最多的水通道蛋白。在胸膜毛细血管的内皮及间皮细胞上有丰富表达，并且进一步研证实大鼠脏层胸膜间皮细胞上AQP1的表达较壁层胸膜更加明显[16]。Zhang等[17]研究发现：AQP1mRNA和VEGF蛋白的高表达与恶性胸腔积液的增加有关，提示AQP1和VEGF在小鼠恶性胸腔积液的发生发展过程中起重要作用。许相范等[18]研究也指出非小细胞肺癌伴有胸水时其癌组织中TNF-α和VEGF高表达导致新生毛细血管增多, 导致胸腔内渗出液不断增多，但是新生血管大量出现时相应的AQP1并未同步增多，从侧面证明癌性胸水与AQP1具有潜在联系。Angelico等[19]研究发现AQP-1在恶性胸腔积液中表达高者的生存时间高于低表达者。因此，若以AQP1为治疗靶点，就有可能促进积液的吸收。例如王兵等[20]采用中药消水方对 Lewis 肺癌伴恶性胸腔积液的小鼠进行治疗，证明中药消水方可能通过下调壁层胸膜间皮细胞 AQP1 mRNA及蛋白表达，从而促进恶性胸腔积液的转运，减少恶性胸腔积液的生成。王珏[21]采用泻肺逐饮汤通过降低胸水和胸膜中AQP1的含量,关闭了促进肿瘤组织血管生成和肿瘤细胞快速扩增的通路,同时也阻断了胸水产生的通道。张琦等[22]研究提示温阳消饮法对胸腔积液大鼠的胸膜水通道蛋白AQP1表达具有明显抑制作用。

3.2水液代谢失衡-AQPs在脏腑中的高表达 水液的代谢，与三焦的关系密切相关，在《圣济总录·痰饮通论》早有论述：“三焦者，水谷之道路，气之所始终也。三焦通调……灌溉周身。若三焦气塞，脉道雍闭，则水饮停积，不得宣行，聚成痰饮。” 所以全身水液代谢的正常，依赖于三焦正常的通利。上焦者乃肺脏，中焦乃脾脏与小肠，下焦肾脏与膀胱，各脏腑之间正常的气化、传输，才能保证水液代谢的相对平衡，而胸水的形成乃是水液代谢失衡的表现。①肺主行水：肺为水之上源，当肺气失宣，津液失于布散，则聚为痰饮，发于胸腔，形成胸水。目前研究亦证明，肺的水液代谢于呼吸道上水通道蛋白的分布有关，水通道家族的AQP1、AQP3、AQP4、AQP5共同参与调节了肺脏的水分子运动[23]。②小肠主液：小肠泌别清浊，是代谢水液吸收最主要的部位，是参与人体水液代谢的重要脏腑。若小肠吸收水液失常，水液可停具于胸中而导致胸水形成。目前研究也证明，小肠上的水通道蛋白的丰富表达是其参与水液吸收的重要机制。例如杨子庆等[24]通过研究发现，苓桂术甘汤和葶苈大枣泻肺汤作为温阳消饮法的代表方治疗胸腔积液的作用机制可能与上调小肠组织AQP4的表达有关。赵欣悦等[25]也亦证实温阳消饮法可上调胸腔积液模型大鼠小肠AQP4的表达。③肾主水：肾为水脏，主水液的气化，有蒸化水液、分清别浊的职责。肺主行水，肾主水，所以肾主水功能失常，则也会导致水饮停聚胸胁。AQP1、AQP2、AQP3均在肾脏组织中分布，而AQP2是肾脏集合管调节水液代谢的关键蛋白[26]。李思思等[27]通过研究温阳消饮法消除胸腔积液与调节肾脏水通道蛋白表达的相关性，发现温阳消饮法可上调胸腔积液大鼠肾脏AQP2表达，能够明显减少胸腔积液模型大鼠的胸腔积液量。李雷兵等[28]研究证实温阳消饮法能有效减少大鼠胸腔积液量，而其上调胸腔积液模型大鼠肾组织AQP2的表达,可能是该法治疗胸腔积液大鼠的部分作用机制。

3.3AQPS与miRNA的相关性 水通道蛋白和miRNA的相关性也是近年来分子生物学的热门研究，虽然目前无明确及直接的对于胸水水通道蛋白的miRNA治疗机制的研究，但是大量文献表明，对影响恶性胸水关键的AQP1、AQP2、AQP3、AQP4等均发现相关的miRNA作用机制。①AQP1与miRNA：目前已证实的可调节AQP1表达的miRNAs包括miR-320a、miR-130a、miR-874等。Jiang等[29]发现MEF2C转录显著上调了AQP1的表达，miR-133a-3p则抑制了AQP1的表达。miR-320a通过对IR后血脊髓屏障 AQP1的负调控，直接在功能上影响脊髓水肿[30]。②AQP2与miRNA：AQP2上存在大量的miRNA结合位点，梁春玲[31]对阿霉素肾病综合征研究发现，真武汤可通过调节集合管miR-92b及AQP2表达,维持集合管细胞功能稳定。③AQP3与miRNA:Su等[32]证明了人类长链非编码RNA (lncRNA) H19可能作为一种竞争性内源性RNA(ceRNA)，通过对miR-874的竞争来调节AQP3的表达，从而在维持肠道屏障功能中发挥重要作用。microRNA-874被证明是PDAC细胞中AQP3表达的关键调控因子[33]。④AQP4与miRNA: miR-93的降低通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活，减轻了ICH大鼠的神经功能和脑水肿，抑制了神经元凋亡[34]。LNA(TM) anti-miR-130a可上调AQP4 M1转录，减少脑梗死，促进康复[35]。miR-29b通过下调AQP-4降低缺血性卒中后血脑屏障的破坏[8]。另还有研究发现miRNA 290和miRNA 494可下调AQP4[36]。⑤AQP5与miRNA：外泌体共表达AQP5-靶向miRNA和IL - 4受体结合肽抑制人类乳腺癌细胞的迁移[37]。miR-96和miR-330均可调控AQP5的表达在脂多糖诱导的大鼠DIC中参与了肺水肿，可能成为分子治疗的潜在靶点[38]。

4 结 语

综上所述，中药外敷在恶性胸水治疗中具有一定作用，其中医治疗机制仍基于“利水”原则，而AQPs在调节人体水液代谢方面起着重要作用。因AQPs在胸膜上及影响水液代谢各组织中的丰富表达，可将其作为切入点，再结合目前论证药效的中医外治miRNA芯片技术及AQPs与miRNA的潜在关联，进行相关miRNAs表达谱筛选工作，从基因层面去揭示中药外敷治疗恶性胸水的作用机制，并可深入研究，对相关靶基因进行进一步预测及验证，最终可构建出中药外敷治疗恶性胸水效应的miRNA-靶基因分子调控通路，为临床应用提供较为可靠的科学依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。