微小RNA与复发性流产研究进展*

涂许许，赵小萱 综述，冯晓玲 审校

1.黑龙江中医药大学研究生院，黑龙江哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学附属第一医院妇科二科，黑龙江哈尔滨 150040

复发性流产(RSA)是指妊娠20周之前的自然流产在同一对配偶中出现2次或2次以上[1]，发病率约为5%，病因包括解剖学异常、染色体异常、内分泌异常、感染、环境污染、自身免疫机制等，但仍有40%～50%的RSA病因不明，被称为不明原因的复发性流产(URSA)[2]。RSA严重影响患病女性的身心健康，使患者及其家庭对生育丧失信心，同时也增加了家庭的经济负担。

微小RNA(miRNA)是一种由22个左右核苷酸构成的非蛋白编码短单链RNA，通过与靶向信使RNA(mRNA)的3′未翻译区域(3′UTR)结合介导基因沉默[3]。miRNA的经典产生途径中，细胞核中DNA被转录为初级miRNA(pri-miRNA)，RNase Ⅲ内切核酸酶Drosha对其切割和处理，并释放60～100 nt的茎环中间体，称为miRNA前体(pre-miRNA)。pre-miRNA还可通过非Drosha依赖的mirtron途径产生。随后Ran-GTP和输出受体Exportin-5将pre-miRNA从细胞核主动转运至细胞质。在细胞质中RNase Ⅲ内切核酸酶Dicer对pre-miRNA进行加工，使其成为miRNA双链，包含了成熟miRNA(15～22 nt)。随后链体解开，成熟miRNA通过Watson-Crick碱基配对机制与mRNA的3′UTR互补序列结合，组装成RNA诱导沉默复合物，调控靶基因的表达[4]。它们在多种生物学过程中发挥作用，包括发育、分化、凋亡和癌变[5]。基于外周血、绒毛和蜕膜的研究已经发现，RSA患者miRNA表达存在显著差异[6]，但对于miRNA参与RSA发生的可能机制仍处于探索阶段，以下将对此做一综述。

1 miRNA介导血管生成参与RSA的发生

在较为稳定的成年人血管网络中，血管的新生是一个相对罕见的事件，但在特殊情况下，例如胚胎的着床和发育中，血管网络可以扩张和重塑以适应不断变化的条件，此过程被称为血管生成，该过程包括3个阶段：启动、增殖-侵袭和成熟-分化[7]。子宫内膜血管生成及受其影响的蜕膜化是胚胎植入成功及成功妊娠的前提。血管生成与胎盘正常发育也有密切联系，胎盘是母体与胎儿进行物质交换的重要场所，胎盘的血管生成有助于建立丰富的血液循环及促进其自身发育，使其更好地实现为胎儿提供营养及排出废物的功能。大多数以流产为结局的妊娠被认为是由于母体螺旋动脉缺乏生理变化而导致胎盘缺陷引起的，胎盘血管发育缺陷及血管内皮功能受损可能导致RSA，血管生成水平受相关细胞因子调节，miRNA可通过影响血管生成相关因子导致RSA的发生[8]。

血管内皮生长因子(VEGF)是关键的血管生成启动因子，来源于绒毛滋养层和绒毛间质巨噬细胞，在妊娠早期蜕膜细胞中高表达，促进血管发育和维持稳定。肖碧如等[9]发现，URSA患者绒毛中miR-29a水平与VEGF及微血管密度(MVD)呈负相关。还有一些研究也发现了RSA中miRNA与VEGF的关系，如URSA患者绒毛中高水平miR-200抑制VEGF，而低水平miR-155降低了血管新生因子sFlt-1的对抗，使血管生成状态发生改变[10]；miR-150抑制VEGF表达[11]；RSA患者的miR-575水平与VEDF呈负相关[6]。

从妊娠早期开始，高度不成熟的血管内皮即使不断膨胀也无法完全满足不断生长的胚胎/胎儿的氧气和营养需要，导致胚胎发育在低氧环境中进行。缺氧诱导因子(HIF)对细胞氧浓度非常敏感，低氧浓度下积累的HIF-1蛋白与HIF-1二聚为有效的转录激活剂，与特定的DNA序列结合，在海绵状滋养细胞的形成中起关键作用，调控胎盘的形成过程。miRNA对HIF有调控作用，URSA患者绒毛中miRNA-223-3p表达水平升高，而Rps6kb1mRNA、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表达水平及MVD均降低[12]。miRNA-223-3p可能通过抑制Rps6kb1/HIF-1α信号通路而使HIF-1α和VEGF表达水平下降，影响血管生成过程，导致绒毛及胎盘血管发育不良，无法供应胚胎及其附属物的发育而导致流产。URSA女性绒毛中miR-210表达水平也被发现与HIF-1α、VEGF、MVD呈负相关[13]，提示miRNA作用于血管生成过程参与RSA的发生。

2 miRNA介导细胞凋亡、增殖参与RSA的发生

细胞凋亡是一种程序性调控的主动死亡过程，是妊娠期的正常生理过程，胎盘绒毛组织的细胞凋亡水平影响胎盘重塑，调节胎盘生长，而蜕膜化的内膜是母胎界面的重要组成部分，参与构成母体与胎儿物质交换的通道，绒毛和蜕膜的凋亡水平异常都可导致流产的发生，miRNA通过对多个信号通路的作用影响细胞凋亡水平，导致RSA的发生[14]。

p53是细胞凋亡和细胞周期的关键调控因子，p53基因编码在DNA修复中起重要作用的53kd磷酸蛋白，p53可以感应DNA损伤并介导下游靶基因而实现调控功能，包括阻滞细胞周期、引起细胞衰老、诱导细胞凋亡、修复DNA等[15]。有研究发现，URSA女性绒毛组织中高表达的let-7f-5p可能通过调控p53信号通路中的MDM-X/MDM2/p53基因，促进细胞凋亡并参与URSA的发生[16]。ZHAO等[17]发现，URSA患者蜕膜中miRNA-365高表达，靶向细胞凋亡抑制因子SGK1下调MDM2及上调p53，造成G1期细胞周期停滞，并诱导细胞凋亡。miRNA也可通过其他通路调节细胞凋亡。

此外，miRNA调节DNA损伤反应(DDR)相关因子，从而影响细胞凋亡水平。DONG等[18]研究发现，RSA患者的绒毛中高表达的miR-520与多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)呈负相关。过表达miR-520的体外人滋养细胞中观察到PARP1水平降低和以DNA损伤为特点的细胞凋亡，而PARP1过表达可恢复凋亡水平。PARP1被认为是DDR中的关键物质，DDR是一种复杂的信号转导途径，响应DNA损伤而被触发，是保持基因组稳定的基础。另一项研究指出，miR-520诱导滋养细胞凋亡的机制可能通过作用于内质网应激通路而实现[19]。

3 miRNA介导免疫耐受参与RSA的发生

妊娠是一种复杂的生理过程，胎儿携带父系基因及父系人类白细胞抗原(HLA)而不受到母体免疫系统的攻击，是因为建立了良好的免疫耐受，RSA的发生与免疫异常相关[20]。

HLA-G是主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰb类抗原，组织表达分布集中，几乎仅在母胎界面处绒毛外滋养细胞中表达，其与自然杀伤细胞受体结合并传递抑制信号,从而使胎儿免受母体淋巴细胞的免疫性攻击,这些现象反映了HLA-G可使胎儿免遭母体免疫系统的排斥[21]。WANG等[22]研究发现，正常核型RSA绒毛中miR-133a表达水平显著升高，可能通过结合HLA-G 3′UTR阻断翻译过程，从而降低HLA-G水平。

母胎微环境中Th1/Th2平衡在正常妊娠中必不可少，ZHAO等[23]发现，URSA患者蜕膜中低水平miR-146a-5p通过TLR/白细胞介素(IL)-1R信号转导途径，产生过量的γ-干扰素(IFN-γ)，破坏Th1/Th2平衡，从而引发URSA。RSA患者miR-155表达水平降低，并与升高的TIM3(Th1的调节蛋白)、IL-4、IL-13及降低的IFN-γ水平具有相关性，提示miR-155可能作用于Th1/Th2平衡而参与RSA[24]。小鼠实验证明了低水平miR-155将导致调节性T细胞(Treg)不足而造成反复的胎儿丢失[25]。

4 影响miRNA表达的因素

4.1表观遗传修饰影响miRNA的表达水平 表观遗传学包括一系列不涉及基因组改变且易受环境影响的可遗传性进程，如DNA甲基化、非编码RNA等。表观遗传学不仅影响细胞分化、发育等生理进程，也被证实参与许多疾病的发生发展过程[26]。

基因附近或内部胞嘧啶-磷酸-鸟苷酸(CpG)甲基化水平的改变可引起基因表达水平的改变，在miRNA基因的表达中也不例外[27]。马天仲等[28]发现，URSA患者绒毛CpG甲基化位点与健康女性存在差异。DNA甲基化水平影响miR-133a-3p表达，RSA患者中高水平miR-133a可能通过抑制细胞增殖而导致RSA的发生。

长链非编码RNA(lncRNA)可通过直接作用于miRNA影响其表达水平。崔进等[29]研究发现，RSA患者胚胎中lncRNA H19水平升高。H19在胎盘转录物中的水平位于第2，是第一批被发现的lncRNA之一。H19位点通过miR-675调节胰岛素样生长因子2(IGF2)及其受体胰岛素样生长因子受体(IGF1R)的水平，IGF1R与IGF2共同影响绒毛的增殖发育过程，参与流产的发生。此外，H19还可影响miRNA-675的靶蛋白NOMO1，从而影响滋养细胞增殖，影响妊娠进程。另一种lncRNA-miRNA的作用方式是“分子海绵”机制。“分子海绵”指lncRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)与miRNA结合，影响miRNA与编码蛋白质的mRNA结合，使miRNA表达水平下降。RSA患者中miR-34a表达水平升高而lncRNASNHG7呈现低水平，lncRNASNHG7 可与miR-34a结合，从而降低miR-34a对滋养细胞增殖和侵袭的抑制作用[30]。

除lncRNA外，环状RNA(circRNA)也具有ceRNA的能力，QIAN等[31]发现，RSA患者绒毛中有8种与健康妊娠期女性差异表达的circRNA，而已有证据显示circRNA可调控miRNA，表明circRNA可能通过ceRNA机制调节miRNA，从而参与RSA的发生[32]。

4.2基因多态性影响miRNA表达水平 单核苷酸多态性或miRNA编码区突变可能改变miRNA的表达及成熟情况。而这种现象在多个国家的RSA患者中被证实。miRNA-27a rs895819 A/G多态性中的GA+GG和G等位基因与埃及女性对RSA的易感性增加有关[33]。有学者发现，韩国RSA女性中，miR-27a变体G等位基因风险较低，而miR-449b变体G等位基因与高风险相关[34]。另一项基于韩国女性的研究提示，miR-25 C>T和miR-222 G>T的组合与RSA的发生有关[35]。在针对中国女性的研究中发现，miR-196a-2中的miR-196a-2 rs11614913 T/T可能通过破坏成熟miR-196a-3p的产生和增强二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达而导致RSA的遗传易感性[36]。另一项研究证实，pri-miR-125a编码区的A>G突变使汉族RSA患者成熟miR-125a表达降低[37]。

5 miRNA检验技术的应用与挑战

生物标志物应提供正常生理状态或病理过程的关键信息，稳定性好，容易通过非侵入性手段获得，可通过简单和廉价的方法检测，且具有良好的特异度。miRNA基本符合这些标准，已被发现在肿瘤、神经系统疾病、心血管系统疾病、病毒感染等疾病中存在变化，从而成为不同细胞事件和疾病诊断、预后和治疗监测的有效生物标志物[38]。

准确、可靠、灵敏的检测方法是miRNA作为新一代生物标志物的前提。目前，分析miRNA最常用的方法都存在其优势和一定的局限性。qRT-PCR灵敏度高，应用广泛，但缺乏多路复用和全基因组覆盖，而且作为基于指数扩增的方法，其中的偏差或错误也会指数级扩增而影响实验结果[39]。印迹杂交(Northern blotting)可用于检测非扩增的miRNA，但其要求原料量大、放射性强，且灵敏度低、耗时长、劳动强度大[40]。原位杂交可展示细胞或组织切片中的时空分布，但技术难度高、费时，且结果不具体[41]。微阵列技术提供全基因组覆盖，但需要特定的探头和专门的设备，数据规范化困难，缺乏不同平台之间的重现性[42]。新一代测序提供全基因组覆盖，识别新的miRNA和miRNA中的单核苷酸多态性，但其需要专门的设备、熟练的生物信息学家且数据分析复杂[43]。等温指数放大灵敏度高，信号放大效率高，不需要热循环设备，但需要包括切割酶在内的多种酶，且探针设计复杂[44]。DNA四面体、DNA折纸、DNA器件和基元等DNA纳米技术可直接检测miRNA，从而消除任何基于扩增的错误，弥补了qRT-PCR和Northern blotting中缺乏多路复用的不足，一些纳米技术还可通过对设备、培训需求的降低从而降低成本和复杂性[38]。

一些miRNA可以在多种不同疾病中朝着相似的方向改变。例如，miR-21表达水平在一些疾病中发生改变，包括心血管疾病、炎症，以及一些癌症，包括乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌和皮肤癌[45-46]。因此，需要对循环的miRNA进行全局筛选，以生成针对特定疾病或癌症类型的miRNA特征，从而提高生物标志物的特异度。年龄、性别、既往治疗方案等因素也必须加以考虑。此外，数据再现性是检测方法、分析方法及数据处理标准化和优化可能产生的另一个主要问题[47-48]。在miRNA可以用作新一代人类疾病的生物标志物之前，miRNA诊断的前景必须与仍然存在挑战的现实相适应。

6 小 结

综上所述，miRNA可能通过参与对于妊娠极其重要的血管生成、细胞侵袭和凋亡、免疫平衡及耐受等过程，从而导致RSA的发生，miRNA受表观遗传、基因多态性等因素的影响而参与RSA进程。尽管miRNA有希望被应用于临床，但仍存在许多问题。现有研究大多数集中于miRNA在RSA中的差异表达，但标本处理方式、孕周、标本类型差异较大，还需要更多实验来确定miRNA参与RSA诊断及治疗的具体应用方案。此外，RSA的发病机制及类型较为复杂，对RSA发生发展过程的进一步研究对于miRNA的临床应用也具有重要意义。希望通过后续研究，可以将miRNA应用于临床，在RSA的治疗方面发挥重要作用。