不同炮制方法对黄芪主要化学成分质量分数的影响1)

张美琦 任伟超 刘美琦 于欣欣 王思嘉 马伟 苏连杰

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

黄芪，豆科(Leguminosae sp.)，黄耆属(AstragalusLinn)，多年生草本植物[1]。黄芪是临床常用的大宗药材，性甘、微温。归脾、肺经，具有补脾益气、升阳、固表止汗等功效。黄芪中含有总多糖[2]、总皂苷[3]、总黄酮[4]三大类主要化学成分，这三大成分在临床上的药理作用十分丰富。在临床用药时，盐处理[5]黄芪入肾经、至下焦、补其虚。研究表明，盐处理会使中药的化学成分含量产生差异[6]，从而导致效用发生变化。因此，本研究通过炒、饭蒸两种炮制方法对盐浸黄芪饮片进行处理，与生黄芪比较，分析其中三大类主要化学成分的变化情况。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限责任公司)、AB204-L型分析天平(深圳市深博瑞仪器仪表有限公司)、150B摇摆式500 g高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)、美国奥泰ELSD6000蒸发光散射检测器(杭州浣熊仪器科技有限公司)、DZTW型电子恒温电热套(力辰科技股份有限公司)、多功能电热锅(四川长虹电器股份有限公司)。

1.2 试验材料与主要试剂

黄芪饮片来自黑龙江省，经黑龙江中医药大学马伟鉴定为蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao)的干燥根。主要试剂有D-无水葡萄糖、黄芪甲苷、芦丁(中国食品药品检定研究院)、腌制盐(山东省盐业集团有限公司)、大米(汤原县瑞龙食贸有限公司)及乙醇、丁醇、硫酸、蒸馏水、苯酚、香草醛、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等。

1.3 样品炮制方法

炒制的盐浸黄芪：取黄芪饮片300 g，加入150 mL盐水(质量分数为5%)，不断搅拌使盐水完全吸入黄芪饮片中，充分润透；把润透后的黄芪饮片置于锅中炒干后(水分不超过10%)，继续炒制10 min(黄芪药材表面为100 ℃)，取出晾干备用。

饭蒸的盐浸黄芪：取黄芪饮片300 g，加入150 mL盐水(质量分数为5%)，不断搅拌使盐水完全吸入黄芪饮片中，充分润透，自然晾干。取400 g大米平铺于容器中，加入800 mL水浸泡大米30 min，使米泡透，再用水浸透屉布平铺于蒸屉中；把泡透的大米平铺于纱布表面，呈直径35.5 cm的圆，平均厚度8 mm，用另一块水浸透的屉布平铺于米上，将润透盐水的黄芪片平铺于屉布上至于锅中。电锅中加入2 500 mL水，加热至圆气时开始计时，电锅(800 W档位)蒸制40 min，取出晾干备用。

1.4 样品溶液制备

总多糖成分的提取：取样品粉末(过5号筛(筛孔内径(180.0±7.6)μm))2.0 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加入40 mL水，密封浸泡24 h。在电热套上加热回流2 h，过滤，将药渣中再次加入40 mL水，加热回流，重复操作2次，合并提取液，浓缩；加250 mL的V(丁醇)∶V(氯仿)为1∶4的溶液充分振摇，用离心机离心15 min；将两溶剂交界处的白色浑浊全部除去[7]，加入150 mL乙醇试剂(体积分数为90%)后，在冰箱中5 ℃静置16 h。过滤得到沉淀物质用乙醇试剂(体积分数为90%)洗涤3次[8]，取沉淀物烘干，称定质量，于1 000 mL容量瓶中定容，加水至刻度，即得。

总皂苷成分的提取：取样品粉末(过5号筛)10.0 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加入200 mL水，密封浸泡24 h。在电热套上加热回流2 h，过滤，将药渣中再次加入200 mL水，加热回流，重复操作2次，合并提取液，浓缩，定容至100 mL容量瓶中；通过大孔吸附树脂柱[9](大孔树脂量，20 g装柱方法，湿法装柱；冲洗柱子溶剂，先采用体积分数为95%乙醇溶液，后用水冲洗至无醇味；浸泡时间24 h)，用100 mL水洗脱到无色，再用体积分数为70%乙醇洗脱，收集洗脱液；在水浴锅上蒸发至干，用无水乙醇溶解定容至200 mL，即得。

总黄酮成分的提取：取样品粉末(过5号筛)20.0 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加入200 mL水，密封浸泡24 h。在电热套上加热回流2 h，过滤，将药渣中再次加入200 mL水，加热回流，重复操作2次，合并提取液，浓缩，定容至200 mL；加到聚酰胺层析柱中[10]，放置48 h，用水洗脱柱子到无色，体积分数为体积分数为90%的乙醇洗脱，收集洗脱液体，用无水乙醇定容至2 500 mL，即得。

2 结果与分析

2.1 总多糖质量分数测定

总多糖成分测定条件：硫酸-苯酚法[11]测定总多糖成分的质量分数，检测波长为491 nm。吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL质量浓度为1.0 g/L的D-无水葡萄糖标准品溶液，分别加水补至2.0 mL，配制成D-无水葡萄糖质量浓度为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/L的标准品溶液；加入1.0 mL刚配的质量分数5.5%苯酚溶液，摇匀；迅速加入5.0 mL浓H2SO4溶液，震荡5 min，随后置于沸水浴中15 min；取出冷却置室温，定容至10 mL容量瓶中；随行空白对照组，在491 nm波长下采用紫外可见分光光度计测定吸光度值；以D-无水葡萄糖标准品待测液质量浓度(ρ)为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标，得到D-无水葡萄糖的标准曲线方程A=2.179 6ρ+0.073 4(0.10≤ρ≤0.35)，R2=0.999 4>0.9，说明线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.0 mL黄芪多糖样品溶液，按标准曲线制备的方法进行操作，随行空白对照组，在491 nm波长处重复以上操作6次，测定吸光度值(A)。精密度试验的相对标准偏差为0.13%，表明仪器可靠，精密度良好。

稳定性试验：精密吸取2.0 mL黄芪多糖样品溶液，按标准曲线制备的方法进行操作，随行空白对照组，分别在491 nm波长处测定供试品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)。结果表明，在5 h内，稳定性试验的相对标准偏差为1.06%。在稳定性试验中，相对标准偏差值不超过3%时，则说明试验稳定性良好。因此，供试品检测时间2 h，在稳定性设定时间5 h之内，说明试验可靠，稳定性良好。

重复性试验：精密称定同一样品药材粉末6份，每份约2.0 g，按标准曲线制备的方法进行操作，随行空白对照组，测定吸光度值(A)，计算6份供试品的黄芪总多糖质量分数。结果表明，黄芪总多糖质量分数平均值为159.9 mg/g，重复性试验测定吸光值的相对标准偏差为1.17%，说明该方法重复性较好。

加样回收率试验：取9份已知黄芪总多糖质量分数的样品溶液1.0 mL，然后分别加入1.0 mL质量浓度为0.160 0、0.319 8、0.479 8 g/L的标准品溶液，按标准曲线制备的显色方法进行显色，随行空白对照组，测定吸光度值(A)，计算黄芪总多糖回收率。结果表明，黄芪总多糖的平均回收率为99.48%；一般中药材回收率要求控制在95%～100%，试验中平均回收率的值符合要求，说明本方法准确率符合要求。

黄芪多糖样品质量分数测定：将已经制备的样品溶液，按照标准曲线的测定方法进行测定，生黄芪总多糖质量分数为159.8 mg/g、炒制盐浸黄芪总多糖质量分数为160.6 mg/g、饭蒸盐浸黄芪总多糖质量分数为158.6 mg/g。

2.2 总皂苷质量分数测定

总皂苷成分测定条件：硫酸-香草醛法测定皂苷类成分的质量分数，检测波长为583 nm。吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL质量浓度为1.0 g/L的黄芪甲苷标准品溶液，置于10 mL离心管中，分别加入无水乙醇至0.5 mL，配制黄芪甲苷质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的标准品溶液；加入体积分数为8%香草醛无水乙醇试剂0.5 mL，摇匀，于冰水浴中加入5 mL体积分数为72% H2SO4溶液；摇匀后，置于62 ℃水浴中20 min，加无水乙醇至10 mL，取出后立即冰浴冷却至室温。随行空白对照组，在583 nm波长下采用紫外可见分光光度计测定吸光度值(A)，得到黄芪甲苷的标准曲线方程A=0.689ρ+0.160 6(0.2≤ρ≤1.0)，R2=0.999 6>0.9，说明线性关系良好。

精密度试验：精密吸取0.2 mL黄芪皂苷样品溶液，按照标准曲线制备的方法进行操作，随行空白对照组，在583 nm波长处重复以上操作6次，测定吸光度值(A)。精密度试验的相对标准偏差为0.33%，表明仪器可靠，精密度良好。

稳定性试验：精密吸取0.2 mL黄芪皂苷样品溶液，按照标准曲线制备的方法进行操作，随行空白对照组，分别在583 nm波长处测定供试品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)。结果表明，在5 h内，稳定性试验的相对标准偏差为1.06%。在稳定性试验中，相对标准偏差值不超过3%时，则说明试验稳定性良好。因此，供试品检测时间3 h，在稳定性设定时间5 h之内，说明试验可靠，稳定性良好。

重复性试验：精密称定同一样品药材粉末6份，每份约10.0 g，按照标准曲线制备的方法进行操作，随行空白对照组，测定吸光度值(A)，计算6份供试品的黄芪总皂苷质量分数。结果表明黄芪总皂苷质量分数平均值为26.2 mg/g，重复性试验的相对标准偏差为1.23%，说明该方法重复性较好。

加样回收率试验：取9份已知黄芪总皂苷质量分数的供试品溶液0.1 mL，然后分别加入0.1 mL质量浓度为0.655、1.310、1.965 g/L的标准品溶液，按照标准曲线制备的方法进行操作，随行空白对照组，测定吸光度值(A)，计算黄芪总皂苷回收率。结果表明，黄芪总皂苷的平均回收率为99.20%；一般中药材回收率要求控制在95%～100%，试验中平均回收率符合要求，说明本方法准确率符合要求。

黄芪皂苷样品质量分数测定：将已经制备的样品溶液，按照标准曲线测定方法进行测定，生黄芪总皂苷质量分数为25.5 mg/g、炒制盐浸黄芪总皂苷质量分数为25.4 mg/g、饭蒸盐浸黄芪总皂苷质量分数为24.6 mg/g。

2.3 总黄酮质量分数测定

总黄酮成分测定条件：亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定黄酮类成分的质量分数，检测波长为510 nm。吸取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL质量浓度为1.0 g/L的芦丁标准品溶液，置于10 mL容量瓶中，加无水乙醇至2 mL，加入质量分数为5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀放置6 min；再加入质量分数10%硝酸铝溶液1 mL，混匀放置6 min；加入浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液4 mL，用体积分数为30%乙醇定容至10 mL容量瓶中，放置15 min。随行空白对照组，在510 nm波长下采用紫外可见分光光度计测定吸光度值(A)，并对结果构建标准曲线方程；以芦丁标准品待测液质量浓度(ρ)为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标，芦丁的标准曲线方程A=1.188 4ρ+0.045 2(0.25≤ρ≤0.65)，R2=0.999 3>0.9，说明线性关系良好。

精密度试验：精密吸取1.0 mL黄芪黄酮样品溶液，按照标准曲线制备的方法进行操作；随行空白对照组，在510 nm波长处重复以上操作6次，测定吸光度值(A)；精密度试验的相对标准偏差为0.43%，表明仪器可靠，精密度良好。

稳定性试验：精密吸取1.0 mL黄芪黄酮样品溶液，按照标准曲线制备的方法进行操作；随行空白对照组，分别510 nm波长处测定供试品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)，在5 h内，稳定性试验的相对标准偏差为0.66%。在稳定性试验中，相对标准偏差值不超过3%时，则说明试验稳定性良好。因此，供试品检测时间2 h，在稳定性设定时间5 h之内，说明试验可靠，稳定性良好。

重复性试验：精密称定同一样品药材粉末6份，每份约20.0 g，按照标准曲线制备的方法进行操作；随行空白对照组，测定吸光度值(A)，计算6份供试品的黄芪总黄酮质量分数。黄芪总黄酮质量分数平均值为114.6 mg/g，重复性试验的相对标准偏差为0.24%，说明该方法重复性较好。

加样回收率试验：取9份已知黄芪总黄酮质量分数的供试品溶液0.5 mL，然后分别加入质量浓度为0.459 2、0.918 4、1.377 6 g/L的标准品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中；按照标准曲线制备的方法进行操作，随行空白对照组，测定吸光度值(A)，计算黄芪总黄酮回收率。结果表明，黄芪总黄酮的平均回收率为98.70%，一般中药材回收率要求控制在95%～100%之间，试验中平均回收率符合要求，说明本方法准确率符合要求。

黄芪黄酮样品质量分数测定：将已经制备的样品溶液，按照标准曲线的测定方法进行测定，生黄芪总黄酮质量分数为114.5 mg/g、炒制盐浸黄芪总黄酮质量分数为113.7 mg/g、饭蒸盐浸黄芪总黄酮质量分数为113.6 mg/g。

3 讨论

黄芪药用历史悠久，也是现代中医临床最常用的大宗药材之一。祖国传统处理药材理论认为，生黄芪主要偏于固表止汗，蜜处理黄芪偏于补虚损、补中益气[12]，而盐处理黄芪主下行入肾，补肾及治崩带淋浊。中药材的化学成分种类繁多，在临床用药过程中，需要针对性地用药，不同的处理方式也会使药材的效用产生一定的差异性。本研究中，炒、饭蒸两种炮制方法对盐浸黄芪饮片进行处理，黄芪中总多糖、总皂苷、总黄酮的质量分数有所不同，药材不同的处理方式，可使药效产生不同的治疗效果。中药黄芪经盐处理后，黄芪总多糖质量分数测定结果，由大到小依次为炒制盐浸黄芪、生黄芪、饭蒸盐浸黄芪。在探讨不同炮制方法对黄芪中多糖成分质量分数影响中发现，生黄芪总多糖质量分数高于盐浸黄芪，其原因是多糖的热稳定性较好，也与处理后黄芪甲苷、氨基酸质量分数降低有关；在本研究中测定的炒制盐浸黄芪的多糖质量分数也是增加。在饭蒸盐浸黄芪处理试验中，采用稻米进行蒸制，稻米中含有氨基酸比较丰富，在蒸制过程中稻米中的氨基酸对盐制后的药材降低的氨基酸质量分数有所补充，使盐制过程中黄芪的氨基酸质量分数变化较小；因此，饭蒸盐浸黄芪的总多糖质量分数有所降低。黄芪总皂苷质量分数，由大到小依次为生黄芪、炒制盐浸黄芪、饭蒸盐浸黄芪，在研究蒙古黄芪、生饮片及其炮制品的质量差异时，生饮片中黄芪甲苷的质量分数高于盐浸黄芪，高温对黄芪甲苷结构造成破坏，高温会影响皂苷类化学成分，使其质量分数降低；本研究中测定，炒制盐浸黄芪的总皂苷质量分数降低。在饭蒸盐浸黄芪处理试验中，长时间的高温蒸制，使总皂苷的质量分数下降，因此饭蒸盐浸黄芪的总皂苷质量分数最低。黄芪总黄酮质量分数，由大到小依次为生黄芪、炒制盐浸黄芪、饭蒸盐浸黄芪；在研究不同方法对黄芪中黄酮成分的影响时，发现盐炙对黄酮类成分质量分数变化无显著影响，本研究中测定炒制盐浸黄芪的总黄酮质量分数略微下降。在饭蒸盐浸黄芪处理试验中，会使总黄酮质量分数略微下降。

总之，中药黄芪的主要化学成分质量分数发生变化，会直接改变黄芪的临床功效，盐处理方式可以以改变黄芪的主要化学成分质量分数，影响其药效。因此，在临床使用中，要进行科学的用药方式达到预期的治疗效果。