外泌体miRNA及其作为肿瘤分子标志物的研究进展*

刘 念 综述,张国军，姚群峰 审校

湖北中医药大学检验学院，湖北武汉430065

恶性肿瘤是对人类健康威胁最大的一类疾病，其发病率和病死率呈逐年上升趋势。恶性肿瘤的早期诊断对于临床精准治疗和预后转归有重要意义。液体活检是一种方便、快速、无创、可多次取样的检测方法，可以动态反映肿瘤基因表达模式的变化,在肿瘤早期诊断及临床治疗中发挥越来越重要的作用。液体活检主要是通过检测血液等体液中的循环肿瘤细胞、游离DNA、循环肿瘤DNA、小分子RNA、外泌体等生物分子，分析评估患者体内肿瘤发生、发展、变化等相关情况，用于肿瘤诊断及辅助治疗等。不同细胞来源的外泌体及其内容物(蛋白质、核酸、糖结合物和脂质等)蕴含丰富的生物学信息，特别是外泌体miRNA与肿瘤发生和发展的关系已引起人们的高度关注，外泌体miRNA有望成为恶性肿瘤早期诊断和预后判断的生物标志物[1-2]。

1 外泌体miRNA

外泌体是一种细胞来源的纳米级的细胞外囊泡，可以通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜等方式观察其形态，用纳米粒子跟踪分析测量其大小和水平。外泌体可以由许多类型的细胞主动分泌，例如红细胞、内皮细胞、神经细胞、树突状细胞和肿瘤细胞等[3]。在血液、尿液、胸腔积液、唾液、支气管肺泡灌洗液和羊水等体液中都存在大量外泌体[4]。来源不同的外泌体内含物成分不尽相同，但大都含有核酸、蛋白质、脂质等，在细胞间信号通讯中发挥重要作用。miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的小单链RNA，它可以通过与靶mRNA的3′-非翻译区或开放阅读框区域结合而介导转录后基因沉默，在细胞增殖、分化、迁移及疾病发生和发展等过程中发挥重要调控作用[5-6]。miRNA不仅存在于血液、唾液、尿液中，外泌体中也含有miRNA。外泌体miRNA因其被磷脂双分子层保护免受RNase的降解，有利于外泌体miRNA的分离提取和储存。当外泌体循环时，外泌体中的miRNA可以被邻近或远处的细胞吸收并调节受体细胞发挥相应的作用，通过循环囊泡传递细胞间信息被认为是信号转导的第3条途径[7]。外泌体miRNA与许多肿瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌和前列腺癌等)的发生、发展及预后关系密切。

2 外泌体miRNA在肿瘤分子诊断中的临床意义

外泌体miRNA具有广泛的生物学效应，它在肿瘤早期筛查、早期诊断、临床治疗和预后等方面的潜在应用价值引起人们的高度关注。对于相同的细胞或组织，病理状态下的外泌体水平远远高于正常生理状态下的外泌体水平，肿瘤细胞来源外泌体的种类和水平与正常细胞也存在明显差异，体液中的外泌体miRNA在肿瘤源性细胞中也有各自的特异性表达。外泌体miRNA与肝细胞癌(HCC)[8]、胰腺癌[9]、乳腺癌[10]等恶性肿瘤的相关性研究都显示外泌体miRNA与肿瘤的发生、发展、临床分型及早期诊断等密切相关，具有十分重要的临床意义，被认为是一种具有广阔前景的肿瘤生物标志物。

2.1外泌体miRNA与肺癌 外泌体miRNA可以用于肺癌的早期诊断和预后评估。JIN等[11]分别检测分析了Ⅰ期非小细胞肺癌(NSCLC)患者和健康个体的血浆外泌体miRNA表达情况，结果显示，肺腺癌特异性表达miR-30e-3p、miR-30a-3、miR-181-5p和miR-361-5p，而肺鳞癌特异性表达miR-10b-5p、miR-320b和miR-15b-5p。相比健康个体，肺癌患者外泌体miR-181b-5p、 miR-10b-5p、miR-361b-5p和miR-320b 的表达存在明显差异(P<0.05)。此外，肿瘤细胞外泌体miRNA还与NSCLC病理分型密切相关。LIU等[12]通过定量聚合酶链反应(qPCR)检测分析了10例肺癌患者和10例健康对照者的84种血浆外泌体miRNA，根据其报道和qPCR检测显示异常表达的外泌体miRNA中选择了9种候选miRNA，以进一步评估其在196例NSCLC患者中的预后作用，通过对患者进行随访和研究分析显示，外泌体miR-23b-3p、miR-10b-5p和miR-21-5p水平升高与总体生存不良有关(P<0.05)，与临床预后变量模型比较时，上述3种外泌体miRNA明显提高了生存预测准确性，结果表明这些外泌体miRNA可以用作肺癌预后生物标志物。刘玉山等[13]同时对NSCLC、肺炎和健康体检者中外泌体miRNA-184的表达情况进行比较，NSCLC患者血清外泌体miRNA-184表达水平明显高于肺炎患者和健康体检者，差异均有统计学意义(P<0.05)，高水平miRNA-184对于NSCLC的临床诊断效能较高。

2.2外泌体miRNA与肝癌 SOHN等[8]研究了血清外泌体miRNA作为HCC生物标志物的可行性，采用实时荧光定量PCR对慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)和HCC患者的血清外泌体miRNA表达水平进行检测，HCC患者血清外泌体miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224水平明显高于CHB和LC患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。HCC患者血清外泌体miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195水平低于CHB患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。BASU等[14]研究发现，外泌体miRNA的传递是HCC细胞间信息交流的一种重要方式，miR-122是肝脏特异性miRNA，它通过外泌体在Huh7细胞和HepG2细胞这两种肝癌细胞间传输，这两种具有不同miR-122表达谱的肝癌细胞之间存在相互作用。

2.3外泌体miRNA与消化道肿瘤 MIN等[15]从已报道的结直肠癌标志物中选择了4种外泌体miRNA，包括let-7b-3p、miR-139-3、miR-145-3p和miR-150-3p，分别进行受试者工作特征曲线分析并计算曲线下面积(AUC)，研究其表达水平差异，AUC值分别为0.792、0.686、0.692、0.679，AUC值均大于0.5,证明其可以对早期结直肠癌患者和具有各种胃肠道症状的非癌变对照者进行较好地区分，对于诊断结直肠癌有一定价值。与选用单个外泌体miRNA生物标志物相比，选择多种miRNA的组合可获得更高的对早期结直肠癌患者的诊断特异度[16]，let-7b-3p和miR-145-3p组合的AUC为0.901，miR-139-3p、miR-145-3p和let-7b-3p组合的AUC为0.927。MADHAVAN等[17]研究报道了胰腺癌患者血清外泌体miRNA水平，相比健康对照组和非恶性疾病患者，83%的胰腺癌患者血清外泌体miR-1246、miR-4306和miR-4644水平明显上升，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示胰腺肿瘤细胞来源的外泌体miRNA水平上升有助于胰腺癌的临床诊断。

2.4外泌体miRNA与其他肿瘤 MENG等[18]测定了上皮来源的卵巢癌患者血清外泌体miRNA，发现卵巢癌患者血清外泌体miR-375、miR-200a、miR-200b和miR-200c表达水平明显高于健康女性，且miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达水平与肿瘤的恶性程度相关。血清外泌体miRNA和血清标志物糖类抗原125联合应用可明显提高卵巢癌诊断的特异度和准确度。胶质母细胞瘤(GBM)来源的外泌体miRNA的表达谱与正常组织细胞存在较大差异。MANTEROLA等[19]研究发现，外泌体miR-320和miR574-3p组合可以将GBM患者与健康个体区分，联合应用可作为诊断GBM的生物标志物。此外，GBM不同的亚型也表现出不同的外泌体miRNA表达谱，外泌体及其miRNA被认为是GBM分子分型的调节者。在前列腺癌患者中外泌体miR-182和miR-183呈高表达[20]，而外泌体miR-375和miR-1290可用于前列腺癌患者的预后评估[21]。

3 外泌体miRNA分离富集与检测

3.1外泌体分离富集 不同的标本类型和研究目的应选择不同的外泌体分离富集方法，超速离心是使用最广泛的外泌体提取方法，但存在所需样品量大、处理时间长和杂质较多等缺点[22]；商业化试剂盒法所需时间较短且可在低离心力下分离，但对外泌体缺乏特异性；聚乙二醇(PEG)共沉淀方法是在4 ℃用PEG孵育样品过夜，然后低速离心分离，可快速分离富集外泌体，但存在外泌体纯度和回收率低的问题。通过免疫磁珠法获得外泌体后，直接用裂解液处理可得到其中的miRNA，该方法提取的外泌体特异度和纯度均较高，且不影响外泌体的结构，但其不适合在大量样本中获取外泌体，且价格昂贵，难以保存。

3.2外泌体miRNA检测 目前，外泌体miRNA检测最常用的方法还是反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)，RT-qPCR灵敏度较高，特异度较好，方法成熟，被认为是miRNA检测的“金标准”。微阵列芯片法可以实现miRNA的高通量测定，更适合用于比较不同的细胞状态之间miRNA的表达水平，但其检测范围较小[23]。此外，近年来基于电化学的纳米生物传感技术越来越多地应用于miRNA的检测。LIU等[24]使用肽核酸和球形核酸协同的“三明治”结构的电化学传感器检测外泌体miRNA，具有高灵敏度和高特异度，能准确进行免疫标记且不依赖酶的miRNA检测。MAJD等[25]利用二硫化钼来修饰场效应晶体管(FET)，构建的FET生物传感器可实现免疫标记超敏感检测miRNA-155。RAMSHANI 等[26]将基于表面声波外泌体裂解微流体芯片与浓缩传感微芯片集成在一起，构建微流控平台来检测miRNA，这种新的集成系统不需要预处理或分析物转移，并且缩短了测定时间，此类微芯片系统通过利用高性能材料构建纳米生物传感平台，并通过多重信号放大，可以实现外泌体miRNA快速、灵敏和特异性检测，具有广阔的应用前景。

4 展 望

综上所述，外泌体miRNA与肿瘤的发生、发展、临床分型及早期诊断等均有十分紧密的关系，而且在肿瘤生长过程中外泌体会不断释放到外周环境中去，因此，可以通过检测体液中外泌体miRNA用于肿瘤的早期诊断、临床治疗和预后判断。相比其他肿瘤早期诊断指标及检测方法，外泌体miRNA作为肿瘤生物标志物有以下优势：(1)体液样品比较容易获得，液体活检取材方便，能够减少取材风险；(2)由于外泌体膜能保护miRNA免受RNA酶的影响，因此外泌体miRNA比血浆miRNA更稳定；(3)与血浆miRNA相比，外泌体包含更高水平的miRNA，如let-7、miR-1、miR-181和miR-375等，更易于检测。目前，有关外泌体miRNA在肿瘤的诊断与治疗中的应用还有待更进一步的深入研究。一方面是还需要开展大样本量的基础研究，提高目标miRNA与不同类型肿瘤之间的特异度，特别是需要构建不同的外泌体miRNA组合与特定肿瘤的相关性表达谱[27-28]；其次还需要深入研究不同种类的miRNA与肿瘤不同发展转化阶段的相关性，筛选出真正的具有早期诊断意义的miRNA；此外，还需要进一步完善外泌体miRNA的检测方法，特别是需要发展建立操作简便、快速灵敏、重现性好的、新的外泌体miRNA检测方法，这将有助于推动外泌体miRNA的临床应用[29]。