Keap1-Nrf2信号通路在角膜急性紫外线损伤防治中的研究进展

朱 雷综述，薛春燕审校

0 引 言

紫外线损伤与多种眼表疾病相关[1]，电光性眼炎(雪盲)最具代表性，由于角膜上皮、间质和内皮受损而产生雾霾、水肿和浑浊，伴有强烈的异物感、刺痛、畏光、流泪及睑痉挛等临床特征。实验研究表明，紫外线暴露会导致角膜抗氧化剂的大量减少，从而导致促氧化剂/抗氧化剂失衡。角膜抗氧化保护能力的降低导致角膜氧化损伤。大量研究讨论了Nrf2信号通路在抗氧化损伤中扮演的角色，其激活后可以上调大量抗氧化基因的表达，在细胞抵抗氧化应激中起重要作用[2]。目前尚无有关Nrf2氧化防御通路与紫外线角膜急性损伤防治的研究报道。本文就Nrf2氧化防御通路与角膜急性紫外线损伤发生、发展的关系进行综述，探讨目前Nrf2在抗氧化损伤方面的作用以及在紫外线角膜急性损伤治疗中的最新进展和潜在可能。

1 紫外线角膜损伤

环境紫外线(ultraviolet, UV)辐射对角膜最常见的急性影响是电光性角膜炎。已有文献报道，在高原行军中，有较多发生雪盲症的官兵[3]。紫外线损伤眼部主要原因之一为活性氧的生成。

1.1 活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)氧化应激是机体氧化物质产生和抗氧化防御之间的不平衡状态[4]，引起氧化应激的罪魁祸首则为ROS，UV暴露可使ROS生成水平高于抗氧化缓冲能力，从而破坏还原-氧化动态平衡，使细胞暴露于氧化应激状态。ROS主要来源于线粒体[5]，包括超氧阴离子(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)。线粒体氧化呼吸链中氧加电子形成O2·-，随之两分子O2·-和一分子H+在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)作用下转换为H2O2和O2。未被正常机体清理的H2O2又被过渡金属Fe2+通过Fenton反应击穿，生成高氧化活性的·OH[6]。

1.2 紫外线引起氧化应激在健康的眼角膜中，吸收和抵抗紫外线辐射是由含有抗氧化剂(抗氧化酶)的组织液完成的。在低分子量抗氧化剂中，抗坏血酸和生育酚是活性氧的重要清除剂。在高分子量抗氧化剂中，SOD催化超氧化物自由基分解为H2O2和O2，H2O2被谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和过氧化氢酶有效清除。兔角膜细胞多次暴露于UVB射线后，GSH-Px和SOD活性显著降低[7]。在Zernii等[8]的实验中，紫外线照射后的兔角膜丙二醛含量远超基线水平，同时SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活性有所下降。上述研究可看出，紫外线暴露后，角膜抗氧化剂含量降低，促氧化剂和氧化剂水平增加，导致抗氧化/氧化失衡。

1.3 氧化应激损伤的分子基础ROS引起蛋白质、脂质以及核和线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)氧化损伤被认为是紫外线诱导氧化应激损伤角膜的主要分子机制。低水平的ROS对维持细胞正常功能有重要作用，包括基因表达、细胞增殖、自我防御[9]。ROS超载影响这些生理进程，促进细胞凋亡或坏死[10]。其以蛋白质为主要靶点，通过氨基酸修饰、肽链断裂、蛋白质交联聚合等氧化损伤蛋白质，尤其是破坏还原型半胱氨酸的结构和功能。·OH和O2·2均可氧化细胞生物膜上多不饱和脂肪酸，破坏生物膜的完整性，降低膜流动性，阻碍生物膜信号转导，引起细胞及其内在的亚细胞器广泛功能障碍、结构破坏。紫外线辐射和氧化产物(尤其是高活性·OH)均将导致DNA双链结构破坏[11]、DNA链断裂，碱基替换等DNA损伤，从而引发多种细胞反应，如细胞周期延迟和细胞凋亡坏死。mtDNA是独立于核DNA的含有37个基因的功能基因组，编码一组对氧化磷酸化至关重要的基因，其缺失或突变将导致线粒体功能障碍[12]。与核DNA相比，由于更接近线粒体内膜，加之mtDNA对氧化应激更敏感，因此大多数遗传物质损伤位于mtDNA中。胞内mtDNA突变累积越多，线粒体对抗氧化应激越敏感，氧化磷酸化过程越脆弱，产生更多ROS[13]，ROS超载转而造成mtDNA突变不断累积，形成恶性闭环。

2 Keap1-Nrf2-ARE信号通路

Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核因子E2相关因子2 (Keap1-Nrf2)系统形成细胞生物抵御外源性和内源性氧化应激的主要节点。Nrf2是该系统顺利运行关键，上面受着Keap1蛋白的调控，下面诱导一系列保护性抗氧化基因的转录。这些抗氧化、解毒酶在增强机体抗氧化，抗炎方面起重要作用。通过调控该系统，增强下游Ⅱ相解毒酶表达，以期达到对抗或减轻紫外线氧化应激角膜损伤的目的给科研工作者提供了良好的思路。

2.1 Keap1生理状态下，Keap1与Nrf2蛋白结合，使Nrf2蛋白锚定于细胞质，无法入核，此时Keap1与CUL3、多泛素化Nrf2形成泛素E3连接酶复合体[14]，协助Nrf2泛素化和降解，正是这种结构性降解使胞内Nrf2浓度和活性维持在较低水平，因此Keap1也被称为Nrf2负调控蛋白。一旦细胞内ROS或亲电子体出现，与Keap1蛋白上半胱氨酸残基结合，Keap1构象改变，Nrf2降解减弱，半衰期延长，入核增加。此时经过氧化应激改变构象的Keap1与此前截然相反，表现为抑制Nrf2泛素化，提高了胞质内Nrf2丰度。综上所述，Keap1-CUL3泛素连接酶复合物的活性控制着Nrf2蛋白水平，Keap1充当闸门角色[14]，当闸门被修改和打开时，Nrf2才会进入细胞核。

2.2 Nrf2Nrf2是一种氧化还原敏感的碱性亮氨酸拉链蛋白,属于帽和领(cap‘n’collar, CNC)转录因子家族成员，调节多种抗氧化基因的转录[15]。6个高保守的环氧氯丙烷同源结构(Neh)在Nrf2功能中发挥不同作用[17]。Nrf2的存在对维持细胞正常生理功能至关重要，其诱导剂保护皮肤免受紫外线辐射引起的皮炎损害[16]，反之基因敲除Nrf2的细胞对外源性刺激敏感性增强[17]。一项对裸鼹鼠的研究表明较高的Nrf2活性与其最长寿命呈正相关[18]，由此研究人员分析裸鼹鼠长寿原因是Nrf2蛋白对氧化应激作出的有效反应，这一作用已经在很多基因编辑的小鼠模型中得到证实，无论是Nrf2或是联合其他基因敲除的小鼠，因此Nrf2被称为是“健康的守护者和物种长寿的门卫”。

2.3 抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)对诱导编码Ⅱ相酶基因转录表达起关键作用的顺式作用元件被命名为ARE，包含特定碱基序列(5′-TTGACnnGC-3′)。Nrf2入核后必须通过与小Maf蛋白二聚化，才能与ARE结合激活Ⅱ相酶基因转录[19]，上调下游Ⅱ相酶包括NADPH 醌氧化还原酶1 (NADPH quinone oxidoreductase-1, NQO1)、血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)、谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase, GST)的表达。

3 Keap1-Nrf2信号通路与紫外线角膜损伤

Nrf2信号通路是一个至关重要的抗氧化防御机制，通过消除ROS，以维持胞内氧化还原平衡。近年来，Nrf2通路的各种激活剂不断被报道，在眼表疾病中的氧化应激保护作用也已在以下眼部疾病的研究中得到阐明:测流香烟烟雾(sidestream cigarette smoke, SCS)暴露引起的干眼[20]和翼状胬肉[22-23]。但是在紫外线角膜急性损伤中，关于Nrf2介导的抗氧化防御机制和相关药物实验的报道很少。

3.1 Nrf2及其诱导剂与氧化应激的对抗多年来，天然产物为潜在的治疗药物的发现提供了有效的资源。随着天然产物单体组分分离纯化技术的不断完善，天然产物中特定的单个成分作为Nrf2激活剂，因其优异的功效而备受关注。其中，许多天然多酚[21-23]抑制ROS的产生，增加Nrf2的核易位和DNA结合能力，干扰Keap1-Nrf2相互作用，促进Keap1泛素化，最终维持机体的生理平衡。在Ma等[17]的实验中，用H2O2处理人白癜风黑色素细胞(human vitiligo melanocytes, HVMs)后，发现细胞内线粒体膜电位显著降低、mtDNA累积增多、ROS水平以及细胞凋亡率增加，这与之前探讨的紫外线通过氧化应激引起细胞损伤的分子机制近乎相同。在上述实验组中加入黄岑素后，发现黄芩素促进了Nrf2从胞浆向细胞核的移位，并增加了HVMs细胞中Nrf2及其下游基因HO-1的表达。在Nrf2基因敲除组中，HVMs细胞更易受到H2O2的刺激，并且用黄芩素去处理Nrf2基因敲除细胞组后，H2O2诱导的细胞凋亡并未受到明显抑制。这些结果表明，黄芩素对H2O2诱导的HVMs细胞氧化应激的保护作用是通过Nrf2信号转导途径实现的。

白藜芦醇(resveratrol, RSV)广泛分布于各种食品中，特别是葡萄，具有抗氧化性能。Liu等[24]发现RSV能有效提高紫外线A(ultraviolet A, UVA)暴露后人角质形成细胞(human keratinocytes, HaCaT)的活性，保护HaCaT细胞免受UVA诱导的氧化应激。此外，Palsamy等[25]研究证实RSV将糖尿病大鼠肾脏中Nrf2/Keap1及其下游调控蛋白的表达正常化，可有效保护肾脏免受高血糖介导的氧化损伤。对天然产物的深入研究，可能为Keap1-Nrf2抗氧化应激的新型治疗药物的设计提供指导。

3.2 Nrf2修复角膜急性紫外线损伤

3.2.1 Nrf2促进角膜自愈大量的暴露于紫外线，引起角膜鳞状上皮细胞脱落，角膜上皮层变薄，严重者角膜上皮层完全脱落[26]。研究人员在角膜损伤模型鼠中用Nrf2特异性siRNA敲除Nrf2基因，发现敲除组角膜上皮细胞的迁移明显延迟，角膜愈合缓慢[27]。相反，用Keap1特异性siRNA敲除Keap1基因，角膜上皮细胞迁移加快，HO-1和NQO1表达增加。同样，大量研究表明Nrf2激活剂促进细胞增殖和迁移，加快角膜伤口愈合[28,29]。因活性氧延迟角膜上皮细胞修复[30]，Nrf2调控角膜上皮细胞迁移促进角膜愈合的机制可能主要还是因为其独特的抗氧化性。

圆锥角膜(keratoconus，KC)是一种常见的退行性角膜扩张疾病，其特征为双侧角膜进行性变薄和扩张，表现为圆锥形凸起。诸多研究表明ROS的过度产生是KC病的关键因素[31-32]，在Liu等[33]的实验中同样得到证实。通过对KC兔模型眼新鲜角膜进行了检测，与对照组相比，KC角膜ROS显著增加，中央角膜厚度显著变薄，而这些变化可通过萝卜硫素(Sulforaphane, SFN)处理中和或逆转。在SFN处理组中，KC角膜中NADPH氧化酶水平下降，Nrf2和HO-1表达增多，如若加入HO-1抑制剂(锌原卟啉IX)可抑制SF对KC角膜的保护作用，因此，该研究证明SF对KC角膜的修复作用至少部分是通过Nrf2抗氧化途径实现的。

3.2.2 Nrf2治疗紫外线角膜损伤潜能越来越多的证据表明，Nrf2在保护角膜免受紫外线氧化应激损伤中扮演不可或缺的角色。考虑到Nrf2在氧化损伤中的作用以及在角膜损伤过程中的调节改变，因此认为Nrf2可成为一个潜在的靶点来保护角膜免受紫外线的损伤。

研究人员用紫外线照射兔角膜8～10 h后立即取下角膜进行评估以观测角膜对UV的早期反应[34]，通过测量氧化线粒体黄素(oxidized mitochondrial flavins, ox-Fvm)来量化细胞内氧化水平，暴露组角膜上皮ox-Fvm信号约是对照组4.5倍，证实UV暴露增加了角膜氧化压力。通过对8-OHdG(DNA氧化损伤主要标志物)测量发现，紫外线照射的眼睛角膜上皮细胞线粒体内8-OHdG的水平显著低于未受照射组2倍，这似乎与之前提到的线粒体DNA对氧化应激更敏感相悖。研究人员分析，UV暴露确可引起上皮细胞内显著氧化，但在线粒体中，这种氧化损伤被线粒体内增加了3.3倍的NADPH所抵消。NADPH是维持胞内还原型谷胱甘肽(G-SH)水平所必须的，G-SH积聚使得角膜对氧化还原状态动态波动具有高度敏感性，给予细胞以快速反应能力。作者认为，在UV照射早期，NADPH浓度增加、G-SH积聚从而调节了抗氧化酶的表达，进而有效限制了UV对角膜的毒性进展。

以上实验证明了紫外线辐射早期阶段，细胞内惊人的抗氧化能力，表现为还原产物多于氧化产物，但在紫外线损伤后期，氧化大于还原的情况最是常见。Nrf2通过严格控制G-SH水平，确保细胞内还原型谷胱甘肽的水平保持不变，以及上调生成NADPH的关键酶的表达，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶1，增加NADPH含量[35]，来缓解甚至逆转后期细胞氧化超载的状态。通过诱导剂唤醒Nrf2-ARE信号通路激发细胞抗氧化潜力，使细胞提前进入紫外线辐射早期阶段或者将后期的糟糕处境逆转为早期强还原状态，达到预防或者治疗电光性眼炎的目的，这仍然需要我们进一步研究。

4 结 语

氧化应激、蛋白质变性、DNA损伤、脂质过氧化和随之而来的细胞凋亡和脱落是紫外线角膜损伤的主要特征。紫外线损伤角膜的机制有待得到全面阐述，本文主要探讨了氧化应激损伤机制。Nrf2是对抗氧化应激的内在防御机制，在氧化条件下被激活，导致大量细胞保护和解毒基因的表达，因此Nrf2信号通路有望在紫外线角膜损伤预防和治疗上产生重大影响。综上所述，Nrf2-Keap1-ARE信号通路是一个有前途的抗紫外线氧化应激靶点，研制以Nrf2-ARE信号通路为靶点的药物，以更方便、安全、快速、高效的方式缓解乃至及早修复紫外线给角膜带来的损伤，为进行高原等强度紫外线环境训练提供强有力的保障。