外泌体在胶质瘤微环境中的研究进展与应用

刘小柳，吴柏灯，张 鑫，曾晓嫚 综述，郑 磊△ 审校

1.深圳大学第三附属医院医学检验科，广东深圳 518001；2.南方医科大学南方医院检验科，广东广州 510515；3.广州三九脑科医院检验科，广东广州 510510

中枢神经系统恶性肿瘤在临床上是预后最差的肿瘤疾病之一，其中恶性胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的中枢神经系统肿瘤，发病率约占脑部肿瘤的1/2,临床上恶性胶质瘤患者的中位生存期只有14～17个月[1]。目前，临床上GBM的治疗手段主要为手术切除、放疗和化疗等方法，但仍有约2/3的患者在治疗10个月内复发，5年生存率仅为5%[2]。GBM是一种高突变率、高异质性、高转移、高复发的肿瘤，通常患者确诊时已处于中晚期，此外由于血脑屏障、手术造成大脑创伤等原因导致临床上GBM的治疗效果不佳[3]，因此，针对GBM寻找疾病早期的生物标志物具有重要临床意义。

细胞外囊泡(EVs)是一种由多种细胞分泌的双层膜性囊泡，内含蛋白质、核酸、脂质等多种生物大分子，可介导细胞间物质/信息传递、细胞增殖分化、血管形成、免疫调节等过程，广泛存在于细胞上清液及多种体液(尿液、唾液、腹水、羊水、母乳、脑脊液、关节液)中，相较于循环肿瘤细胞(CTCs)与循环肿瘤DNA(ctDNA)，EVs具有稳定性高、数量级大、取材方便等特点，有望成为一种新型的疾病诊断标志物[4-6]。EVs主要分为外泌体(补充)、微囊泡和凋亡小体三大类[4]。其中，外泌体是由多囊泡体与细胞膜融合形成，呈杯状/双凹碟状，直径为30～150 nm，浮力密度为1.11～1.18 g/mL，研究表明这一类小粒径的EVs被认为与多种疾病(如肿瘤、心血管疾病、阿尔茨海默病等)有关[5]。

目前，检测外泌体的相关技术主要包括外泌体的分离富集与鉴定，分离富集方法主要有差速超速离心法、密度梯度超速离心法、免疫分离法、聚合沉淀法、切向流超滤法、尺寸排阻色谱法和微流控芯片分离法等[7]。差速超速离心法是提取EVs的“金标准”[6]，微流控技术凭借其所需样品量小，分离和检测集成化，灵敏度高等优势开始被临床使用。外泌体的鉴定包括通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、原子力显微镜及随机光学重构显微镜等对其形态学表征进行鉴定；利用纳米粒子追踪分析与动态光散射对其浓度/径粒进行实时分析[7]；利用免疫蛋白印迹法对其特异性蛋白分子进行鉴定；利用拓扑技术对其累加组分进行鉴定[8]。

肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤中具有自我更新和异质性分化能力的细胞亚群[9]，在肿瘤发生、发展及治疗后复发中扮演重要角色。CSCs功能的执行依赖其周围微环境的信号刺激，CSCs微环境的破坏可损伤其自我更新功能，从而抑制肿瘤的生长，CSCs的存在是胶质瘤复发的主要原因；外泌体及其内包含的生物信号分子，被认为是GSCs与肿瘤微环境间的“信息通讯使者”，是重要的生物标志物和治疗载体[10-12]。因此，探讨外泌体在CSCs微环境中信息交流的作用，以及其产生的生物学后果对神经胶质瘤诊断与治疗至关重要。本文将对外泌体在胶质瘤微环境中的作用和在肿瘤发生发展中的研究进展进行简要综述。

1 外泌体在胶质瘤微环境中的作用

胶质瘤微环境是由肿瘤细胞、血管周细胞、细胞外基质、固有免疫细胞(小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞)、T淋巴细胞、神经元细胞、星形胶质细胞等多种类型细胞组成的。其中胶质瘤细胞来源的外泌体可以“驯化”其他邻居细胞，诱导其自身特性发生改变，从而促进肿瘤细胞的生长[10]。GBM与周围的非癌细胞相互作用，以维持有利于肿瘤增殖、肿瘤侵袭、血管生成、免疫抑制及肿瘤耐药的微环境，涉及多种通信模式，例如可溶性因子，间隙连接通信。

由肿瘤细胞外泌体携带和释放的生物分子不但包括可溶性蛋白，还包括可改变受体细胞中基因表达的多种编码和非编码RNA[11]，蛋白质和miRNA可以诱导受体细胞表型修饰和细胞外基质重塑[12]，从而在肿瘤细胞的生长中发挥作用。

1.1外泌体与细胞外基质 胶质瘤的形成和侵袭迁移的主要生物学过程与细胞外基质重塑有关[13]。细胞外基质是一种高度动态的结构，其重塑受融合素样金属蛋白酶(MMP)与基质MMP的调节，后者有助于基底膜的降解并通过细胞内骨架重排，致使细胞外基质降解、重塑，MMP表达变化与胶质瘤组织病理学分级相关[14]。据研究显示，由胶质瘤细胞产生的EVs含有MMP-2明胶酶、pro-MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制因子1和基质金属蛋白酶组织抑制因子2，具有促进血管生成的作用[15-20]。

1.2外泌体对单核细胞和巨噬细胞的影响 浸润性单核细胞是GBM微环境中是最普遍的细胞类型，也被称为肿瘤相关巨噬细胞[15]，GBM引起的血脑屏障破坏导致单核细胞浸润，随后可分化为巨噬细胞，在胶质母细胞瘤的炎性反应中，巨噬细胞所占比例为20%，分为M1和M2 2种表型[21]，具有经典M1表型的巨噬细胞具有吞噬、促进抗原表达和促炎作用，M2型则失去其促炎和抗肿瘤作用，具有促进肿瘤侵袭和肿瘤内血管生长的作用，从而使环境有利于肿瘤细胞生长[22]。研究表明，在GBM细胞系U87和GSCs释放的EVs中分离出的外泌体，主要靶向单核细胞以诱导肌动蛋白细胞骨架的重组和免疫抑制性M2表型，并分泌单核细胞趋化蛋白3、趋化因子CXC基序配体1(CXCL1)，以及程序性死亡配体1(PD-L1)[16]。单核细胞PD-L1的表达可能是癌症诱导的免疫逃逸的表型改变，PD-L1的存在可与活化T淋巴细胞的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合以抑制T淋巴细胞功能[23-24]，也可参与巨噬细胞的激活，导致巨噬细胞在异常条件下的过度增殖[25]。

1.3外泌体对星形胶质细胞的影响 星形胶质细胞作为大脑中固有的先天免疫细胞，可有助于防御病原体的刺激[26]，肿瘤周围的星形胶质细胞可促进GBM的进展。有研究表明，由GBM释放的EVs可驱动星形胶质细胞的肿瘤支持作用，源于患者的GBM的EVs培养的星形胶质细胞可促进肿瘤生长，同时表皮成长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、集落刺激因子(CSF)、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子，趋化因子(CXCL1、CXCL19、CXCL110、CXCL111)、趋化因子CC基序配体、MMP9、可以诱导免疫抑制的细胞因子(CSF-2、CSF-3)、白细胞介素(IL)-4、IL-10和IL-13等在体内也可促进GBM的入侵和扩增[27-28]。研究表明GBM的EVs可以修饰周边星形胶质细胞以诱导肿瘤支持功能，还可以驱动星形胶质细胞发生恶性转化从而致癌[27-28]。

1.4外泌体对GBM干细胞的影响 KIM等[19]指出间充质干细胞对多种恶性肿瘤生长具有明显的抑制作用。经间充质干细胞移植后，可趋向脑内胶质瘤部位，进而通过旁分泌MSC-EVs等因子来调节肿瘤细胞微环境，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。直接MSC-EVS静脉注射可以代替间充质干细胞移植，对胶质瘤起到抑制生长的作用。

GBM包含类似于间充质干细胞的基质细胞，其通过依赖于IL-6分泌的机制参与了GSCs致瘤性，FIGUEROA[20]等研究发现手术标本中的GBM间充质干细胞可释放EVs，通过转移miR-1587来增加GSC的增殖和克隆性，这反过来又导致肿瘤抑制因子NCOR1(核激素)的表达下降，PALUMBO等[21]证明GSCs释放了可以诱导GBM细胞成瘤作用的EVs，由GSC释放的EVs对黏附的GBM细胞系U87MG的细胞生长和迁移具有刺激作用。用细胞黏附分子L1CAM修饰的GSC衍生的EVs也能够诱导不同类型的GBM细胞系的运动性，增殖和侵袭性。RICKLEFS等[22]证明了由GSCs释放的EVs保留了肿瘤亚型特征，并且它们在GSC亚型之间的转移导致靶GSC的致瘤性改变。

GBM相关的人间充质干细胞外泌体中的miR-1587被受体CSCs摄取后通过下调肿瘤抑制基因NCOR1的表达来提高CSCs的致瘤性[23]。综上所述，外泌体在GSCs微环境中对CSCs与肿瘤细胞动态转化过程中发挥重要作用，维持GSCs群的稳定，为肿瘤的生存和发展提供有效保障。

1.5外泌体与肿瘤血管生成 周围血管中氧气和营养物质的供给有利于肿瘤的生长，肿瘤可以改造其微环境至有利于创建自己的血管系统。其中，CSCs可以通过分泌促血管生成因子如VEGF、SDF-1α、IL-8和CXCR-4来诱导血管的生成[24]，也可通过分泌外泌体被内皮细胞摄取促进新血管生成。在胶质母细胞瘤中，SUN等[25]发现GSCs的外泌体中的miR-21通过激活内皮细胞miR-21/VEGF/VEGFR2信号通路促进血管生成，胶质瘤干细胞来源的外泌体可以提高血管内皮细胞的增殖能力，促进内皮细胞迁移，表明在胶质瘤微环境中胶质干细胞可利用外泌体实现其与血管内皮细胞之间生物学信息的交流。

2 外泌体在脑胶质瘤诊断和治疗中的应用

2.1外泌体作为抗肿瘤靶向药物载体 受治疗脑肿瘤药物在体内的不稳定性和血脑屏障的限制，其疗效甚差，研发能够透过血脑屏障，使药物可直接靶向作用于原发肿瘤的新型给药系统将有效提高抗肿瘤药物的效能。外泌体是人体分泌的膜性囊泡，具有稳定性高、生物相容性好、免疫源性低，血脑屏障透过性好等特性，是药物靶向投递的最佳载体，借助超声波和室温孵育将紫杉醇组装于胶质瘤细胞系U87来源的外泌体中，可见载有紫杉醇的外泌体对U87细胞的毒性明显增加[26]。外泌体miR-34a能够特异性负向调控胶质母细胞瘤n-Myc基因的表达，鉴于人骨髓间充质干细胞可迁移至肿瘤部位的特性，利用人骨髓间充质干细胞来源的外泌体将过表达的外源性miR-34a递送至肿瘤细胞，使n-Myc基因沉默，提高胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性，以达到抑制肿瘤细胞生长的目的，NIE等[27]发现药物敏感性肿瘤细胞来源的外泌体可逆转耐药肿瘤细胞的耐药性。因此，外泌体除能够靶向传递抗肿瘤药物、促进其吸收等功能外，还可在逆转肿瘤细胞耐药性方面发挥作用，也为外泌体在各种肿瘤的无创诊断、预后判断及治疗中提供新的方法思路[28-29]。

2.2外泌体作为免疫疗法的介入靶点 胶质瘤发生发展的主要原因即是其免疫逃避。DOMENIS等[30]针对胶质瘤干细胞外泌体对不同外周免疫细胞群的免疫调节特性进行观察，发现经胶质瘤干细胞外泌体处理的外周血单核细胞具有抑制T淋巴细胞活化、增殖和辅助性T细胞1(Th1)细胞因子产生的能力，同时不影响细胞活力或抑制T淋巴细胞功能。胶质瘤外泌体主要通过作用于单核细胞，抑制T淋巴细胞的免疫应答，外泌体在选择性靶向治疗胶质瘤时对免疫细胞产生效应，从而减缓或阻止肿瘤进展。而且，胶质母细胞瘤来源的外泌体还可将免疫调节分子转移到免疫细胞，形成对应的肿瘤免疫微环境[31]。因此，通过抑制外泌体的分泌，改变胶质母细胞瘤组织中的微环境，可能是未来控制其侵袭、迁移的策略之一。

3 结 论

EVs是GBM细胞与肿瘤微环境通讯的重要信号载体，GBM衍生的EVs可被肿瘤环境的不同组成部分例如TAMs，内皮细胞，星形胶质细胞和GSCs吸收，从而参与肿瘤生长、肿瘤侵袭、新血管生成、肿瘤转化、肿瘤耐药和免疫应答调节等。来自肿瘤周围的细胞也释放出针对GBM的EVs，参与GBM的进展，未来治疗策略可能旨在阻断GBM细胞与基质间质之间建立的这种EVs介导的信息交流。综上所述，EVs具有传递信号分子、调节细胞及周围微环境的作用，作为疾病标志物，在疾病“液体活检”中具有巨大的前景，不仅可以作为监测肿瘤复发、预测患者预后的生物学标志物，还有望成为携带靶向药物的载体。