血浆母系表达基因3和H19水平与妊娠期糖尿病胰岛素抵抗的关系

宋晓东，朱学涛，朱立梅，李 伟

0 引 言

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期间首次发生或发现的糖代谢异常，可能引起孕妇发生流产、围生期酮症酸中毒、产后出血等多种合并症，对胎儿也构成极大威胁，可能造成胎儿窘迫、早产、畸形等，孕期行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)筛查并及时进行干预，可改善妊娠结局。GDM机制复杂，一般认为与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)有关，尽早发现IR，并采取相关措施进行控制，对于降低GDM发病风险有重要意义[1-2]。哺乳动物基因组中98%转录序列不具备蛋白质编码功能，属于非编码RNA，其中长度在200个核苷酸以上的为长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)，母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)、H19均属于LncRNA。MEG3基因定位于人染色体14q32.3，具高度保守性，已有研究表明其在人胰岛β细胞中为高表达，可促进胰岛素分泌[3-4]。H19定位于人染色体11p15.5，包含5个外显子，4个内含子，具父系印记特性，选择性表达母源性等位基因，是最早被鉴定的印迹基因之一，已被报道与IR密切相关[5]。本研究通过探讨血浆MEG3、H19水平与GDM患者IR的关系，以期为GDM的发病机制及临床防治工作提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年1月至2019年1月孕24～28周在我院行OGTT并确诊为GDM的孕妇65例为GDM组，年龄22～37岁。参照文献[6]的诊断标准：将75 g葡萄糖溶于250～300 mL水中，受试者在5 min内口服完毕，分别采集服用后1 h、2 h静脉血，检测血糖水平，满足以下任何一项即可诊断为GDM：空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)≥5.1 mmol/L，服糖1 h血糖≥10.0 mmol/L，服糖2 h血糖≥8.5 mmol/L。纳入标准：①经OGTT确诊为GDM；②首次、单胎妊娠。排除标准：①曾被诊断为糖尿病者；②多胎妊娠者；③有糖尿病家族史者；④肝、肾等重要器官功能障碍者；⑤临床资料不完整者。另外选取同期80例孕周为24～28周正常妊娠孕妇为对照组，年龄23～38岁。本研究经医院伦理委员会批准(批号：201511003)，所有受试者均自愿签署知情同意书。

1.2 方法受试者均于清晨抽取5 mL空腹静脉血。FPG水平采用日立7600型生化分析仪测定，糖化血红蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)采用Arkray HA-8180型全自动分析仪(日本)检测；采用放射免疫法检测空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)水平，试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；采用稳态评估模型评估胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，HOMA-IR≥2.69即判为IR[7]。计算公式：

HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5

采用qRT-PCR检测血浆中MEG3、H19水平，仪器为Roche LightCycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪。采用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，进行PCR扩增反应。以GAPDH为内参基因，MEG3正向引物：5′-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3′，反向引物：5′-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3′，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。H19正向引物：5′-ACAGGAGAGAGACTTCCA-3′，反向引物：5′-ATGTCCTGCTTGTCACGTCC-3′，反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环，引物及试剂盒均购于上海生工生物工程有限公司，操作严格按照说明书进行，采用2-ΔΔCt法计算MEG3、H19水平。

2 结 果

2.1 一般资料比较2组年龄、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。GDM组FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均显著高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 入组孕妇一般资料比较

2.2 血浆MEG3、H19水平比较GDM组血浆MEG3水平显著低于对照组(P<0.01)，H19水平显著高于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 入组孕妇血浆MEG3、H19水平比较

2.3 GDM组血浆MEG3、H19水平与FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR相关性分析Spearman相关分析结果显示，GDM组血浆MEG3水平与FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均呈负相关(P<0.01)，血浆H19水平与FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均呈正相关(P<0.01)，见表3。

表3 GDM组血浆MEG3、H19水平与FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR相关性分析

2.4 影响IR发生的多因素Logistic回归分析以是否发生IR为因变量，以MEG3、H19水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果表明，MEG3是IR发生的保护因素(P<0.01)，H19是危险因素(P<0.01)，见表4。

表4 影响胰岛素抵抗(IR)发生的多因素Logistic回归分析结果

3 讨 论

GDM是妊娠期常见糖代谢异常疾病，是日后患2型糖尿病的高危人群，随着饮食结构变化、肥胖及高龄产妇的增加，近年发生率呈逐渐升高趋势，我国发生率约为1%～5%[8]。GDM发病机制目前尚未阐明，研究发现发病原因可能是妊娠期雌激素、生乳素等由胎盘分泌的激素释放进入母体循环使全身水平升高，增强了对胰岛素的拮抗作用，随孕周增加胰岛素敏感性下降，胰岛素分泌受限的孕妇则发展为GDM[9-11]。胰岛β细胞合成分泌的胰岛素是机体内唯一具有降低血糖功能的蛋白质类激素，在维持血糖水平上起决定性作用[4]。IR是指胰岛素促进机体摄取及利用葡萄糖能力下降，正常妊娠女性随着体内激素水平变化可表现出生理性、暂时性IR状态，通常在孕周24～28周表现显著，于34～36周达到峰值，在分娩后逐渐消失，GDM患者生理性、病理性IR并存[11-12]。本研究发现，与对照组比较，GDM组FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均较高，提示GDM患者存在不同程度IR，与上述研究结果一致。

LncRNA可在转录及转录后水平调控基因表达，参与细胞信号传导、细胞增殖分化、免疫应答等多种生理活动过程，与肿瘤、代谢性疾病等关系密切，正常生理状态下，MEG3在机体组织中为高表达，在肿瘤组织中表达降低或缺失，发挥抑癌基因作用[13]。近年来LncRNA与IR的关系引起诸多研究者的兴趣，LncRNA的作用发挥具组织特异性，同一种LncRNA在不同组织中对血糖可能发挥相反调节作用。研究发现，小鼠胰腺组织中MEG3与心、肝、脾等组织相比为高表达，具有组织特异性，抑制MEG3表达后，胰岛素分泌量减少，胰岛β细胞凋亡增加，与此同时，葡萄糖耐受能力受损，MEG3可能通过参与胰岛素的合成及分泌，在维持成年小鼠胰岛功能中发挥重要作用[3-4]。本研究发现，GDM组血浆MEG3水平显著低于对照组，提示MEG3可能参与GDM患者IR的发生。分析原因是低水平的MEG3可能通过对胰十二指肠同源盒因子-1肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A基因表达产生抑制作用，进而使胰岛素合成、分泌减少[14]。另有研究表明，MEG3与肝糖异生关系密切，MEG3可通过激活叉头框蛋白1，增加葡萄糖6磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶表达，从而促进糖异生，减少糖原合成[5]。

H19在胚胎发育中呈现高表达并在出生后显著下降，仅在成年人骨骼肌及心肌中观察到持续表达，在肿瘤等细胞大量分化疾病中呈现高表达[15]。H19在不同的肿瘤中表达情况各异，在胃癌、宫颈癌、胰腺癌等肿瘤中呈现高表达，发挥促癌基因作用，在前列腺癌、肝癌等肿瘤中呈现低表达，发挥抑癌基因特性，H19在不同肿瘤中可能发挥不同作用，甚至在同一肿瘤中发挥促癌及抑癌基因的双重作用[16]。H19与IR的研究越来越受到关注，研究表明，H19在高脂饮食小鼠肝脏中高表达，高水平的H19可促进肝脏产生葡萄糖，进而增加高血糖、IR发生风险，全身敲除H19可使胰岛素抑制肝脏糖异生的作用增强，但也有研究表明，下调肝脏中H19表达，可使小鼠血糖水平升高，糖耐量受损，糖异生基因表达上调，上述结论提示H19在肝糖异生中发挥的作用目前尚不明确[5,17-18]。本研究发现，GDM组血浆H19水平显著高于对照组，提示H19与IR关系密切。Spearman相关分析结果显示，GDM组血浆MEG3、H19水平与FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均具相关性，提示MEG3、H19可能用于评估GDM患者IR严重程度。多因素Logistic回归分析结果显示，MEG3是IR发生的保护因素，H19是危险因素，可能从危险因素方面防治IR，降低不良妊娠结局的发生。

综上所述，GDM患者血浆MEG3呈低表达，H19为高表达，且与HOMA-IR具相关性，或可为GDM的靶向治疗提供新思路，本研究也存在不足之处，样本量较少，可能造成结果偏差，尚需大样本研究对结果进行佐证，这将成为今后的工作重点。