黑松松针多糖的复合酶法提取及其抑菌性研究

谢 玮 ，郭宗明 ，葛胜菊 ，肖 川 ，陈 静

（1.烟台南山学院健康学院，山东 烟台 265713；2.烟台南山学院工学院，山东 烟台 265713）

黑松是我国重要的景观造林植物之一，松针是松科植物的针叶，是松树重要的副产物之一，富含多种活性成分，如黄酮、木脂素、莽草酸、挥发油、多糖等[1]。松针的食用、药用价值历史悠久。徐瑞等[2]研究证实，在饲料中添加2%松针粉等量替代麸皮或直接添加2%松针粉均有提高生猪生长性能、降低咳嗽发生、提高机体免疫的效果。周思杰等[3]采用超声波酶法优化雪松松针多糖的提取工艺，并证实提取的松针粗多糖有较好的抗氧化性。将松针中的生物活性成分进行提取后再添加到饲料中，有利于提高禽畜饲料转化率，改善动物的免疫机能，提高经济效益。目前，松针多糖的提取工艺有水提法、酸提法、碱提法、超声法、微波法等[4-5]。本文采用分步加酶法研究复合酶法提取黑松松针多糖的工艺，并与同步加酶法进行比较，优化提取工艺，以期为提取黑松松针多糖的工艺优化提供一定的参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

黑松松针，采自烟台南山学院东海校区。纤维素酶，酶活力≥105U/mg，购于和氏璧生物工程有限公司；果胶酶，酶活力≥2×104U/mg，购于上海蓝季科技发展有限公司；石油醚、无水乙醇、柠檬酸、磷酸二氢钠、葡萄糖、硫酸等试剂均为分析纯。试验用水均为蒸馏水。大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），均由本校食品系微生物试验室提供。

1.1.2 仪器与设备

800 T 型粉碎机，永康市荣浩工贸有限公司；GZX-9240MBE 型恒温鼓风干燥箱，上海博讯实业有限责任公司；FA2004 型电子天平，上海舜宇恒平科技仪器有限公司；HH-2 型恒温水浴锅，上海梅香仪器有限公司；722-P 型分光光度计，上海现科分光仪器有限公司；LDZX-30FBS 型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；MJ106B-Z 型培养箱，上海博讯实业有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 黑松松针的预处理工艺流程

采集松针→清洗→去除两端末梢→80 ℃烘干→粉碎→松针粉过筛（依次 40 目、80 目、100 目过筛）→脱脂（石油醚）→烘干、备用

1.2.2 黑松松针多糖的提取工艺

称取预处理好的松针粉1.0 g，以蒸馏水为提取剂，在预试验的基础上，在不同的液料比、酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH 条件下进行酶解提取试验，以磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液来调节反应液的酸性环境，酶解结束后沸水浴10 min 灭酶终止酶解反应，调节pH 至7.0，将酶解后的提取液进行抽滤，合并滤液进行浓缩处理，加入4 倍体积的95%乙醇，4 ℃条件下静置12 h，以4 000 r/min 离心15 min，收集沉淀并冷冻干燥得黑松松针粗多糖。

1.2.3 单因素试验设计

本试验对提取出的黑松松针多糖分别选用纤维素酶和果胶酶进行处理，依次考察液料比、酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH 对黑松松针多糖得率的影响。

1.2.3.1 液料比对黑松松针多糖得率的影响

精密称取1.0 g 预处理好的黑松松针粉，依次按照不同的液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g））混合均匀，纤维素酶和果胶酶的添加量均为2%（设定提取剂体积为100%，下同），用50 ℃水浴酶解2 h，沸水浴10 min 灭酶终止酶解反应，调节pH 至7.0，提取黑松松针多糖，分别考察纤维素酶和果胶酶在不同液料比条件下提取的黑松松针多糖得率。

1.2.3.2 酶添加量对黑松松针多糖得率的影响

精密称取1.0 g 预处理好的黑松松针粉，按照液料比 20∶1（mL/g）混合均匀，在不同酶添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）条件下，用 50 ℃水浴酶解2 h，沸水浴10 min 灭酶终止酶解反应，调节pH 至7.0，提取黑松松针多糖，分别考察纤维素酶和果胶酶在不同酶添加量时的黑松松针多糖得率。

1.2.3.3 酶解温度对黑松松针多糖得率的影响

精密称取1.0 g 预处理好的黑松松针粉，按照液料比 20∶1（mL/g）混合均匀，纤维素酶添加量 2.5%，果胶酶添加量 1.5%，在不同温度（40、45、50、55、60 ℃）条件下水浴酶解2 h，沸水浴10 min 灭酶终止酶解反应，调节pH 至7.0，提取黑松松针多糖，分别考察纤维素酶和果胶酶在不同酶解温度下提取的黑松松针多糖得率。

1.2.3.4 酶解时间黑松松针多糖得率的影响

精密称取1.0 g 预处理好的黑松松针粉，按照液料比 20∶1（mL/g）混合均匀，纤维素酶添加量 2.5%，果胶酶添加量1.5%，于50 ℃条件下分别水浴酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，沸水浴 10 min 灭酶终止酶解反应，调节pH 至7.0，提取黑松松针多糖，分别考察纤维素酶和果胶酶在不同酶解时间下提取的黑松松针多糖得率。

1.2.3.5 pH 对黑松松针多糖得率的影响

精密称取1.0 g 预处理好的黑松松针粉，按照液料比 20∶1（mL/g）混合均匀后，在不同 pH（5.5，6.0，6.5，7.0，7.5）下，纤维素酶添加量 2.5%，果胶酶添加量在1.5%，50 ℃水浴酶解（纤维素酶酶解2 h，果胶酶酶解1.5 h），沸水浴10 min 灭酶终止酶解反应，调节pH 至7.0，提取黑松松针多糖，分别考察纤维素酶和果胶酶在不同pH 条件下提取的黑松松针多糖得率。

1.2.4 正交试验设计

在单因素试验的基础上，分别选取纤维素酶、果胶酶，按照液料比、酶添加量、酶解温度、酶解时间5个因素，设计五因素四水平的正交试验L16（45），以确定最优提取条件。试验因素水平见表1 和表2。

表1 纤维素酶提取松针多糖的正交试验因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal test for extraction of pine needle polysaccharides by cellulase

表2 果胶酶提取松针多糖反应的正交试验因素水平表Table 2 Factor and level of orthogonal test for extraction of pine needle polysaccharides by pectinase

1.2.5 复合酶法提取黑松松针多糖

根据纤维素酶和果胶酶的正交试验结果，采用复合酶法（纤维素酶、果胶酶）来提取黑松松针多糖，同时研究两种加酶方法对黑松松针多糖得率的影响。一种为同步加酶法，即将纤维素酶和果胶酶按照各自最适浓度一次性同时加入；另一种采用分步加酶法，即两种酶分别在各自的最适条件下按照先a 后b（a→b）和先 b 后 a（b→a）的顺序加入进行提取（a 为纤维素酶、b 为果胶酶），探究不同加酶方法对黑松松针多糖得率的影响。

1.2.6 黑松松针多糖得率测定

采用苯酚-硫酸比色法[6]测定。制备葡萄糖标准曲线，以标准溶液浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，并进行回归处理，得到回归方程：y=7.768 7x+0.049 8，R2=0.999 3。结果表明，葡萄糖溶液在0～4.0 mg 范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.2.7 黑松松针抑菌性能研究

采用纸片扩散法[7]，考察黑松松针多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的体外抑菌效果，以无菌生理盐水为空白对照，37 ℃条件下培养48 h 后观察并测量抑菌圈直径。

1.2.8 数据处理

所有试验均重复测定3 次，结果取平均值。采用Origin Pro 8.0 软件进行数据制图，数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对黑松松针多糖得率的影响

由图1 可见，随着液料比的增加，纤维素酶、果胶酶提取黑松松针多糖的得率逐渐增加。这是因为液料比的适当增加，促进提取液内物质的流动，有利于多糖的溶解，进而提高多糖得率。采用纤维素酶和果胶酶单一酶提取黑松松针多糖的最佳液料比均为20∶1（mL/g），其中使用纤维素酶提取的多糖得率稍高。但当液料比继续增加，酶浓度逐渐降低，导致酶与底物结合不充分，最终使多糖得率降低。这与周思杰等[3]、范文奇等[8]的研究结果相似。

图1 液料比对黑松松针多糖得率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.2 酶添加量对黑松松针多糖得率的影响

由图2 可见，随着酶添加量的增加，松针多糖得率均呈现先增加后减少的趋势。纤维素酶添加量为2.5%时，黑松松针多糖得率最高；果胶酶添加量为1.5%时，黑松松针多糖得率最高。推测原因是随着酶添加量的增加，酶与底物接触机会增多，使得多糖提取率呈现上升趋势，但当酶添加量继续增加时，底物浓度逐渐降低，酶对溶出的多糖也开始起作用，最终导致多糖得率下降。

图2 酶添加量对黑松松针多糖得率的影响Fig.2 Effect of enzyme concentration on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.3 酶解温度对黑松松针多糖得率的影响

由图3 可见，随着酶解温度的升高，黑松松针多糖得率也不断提高，使用纤维素酶和果胶酶单一酶提取的松针多糖均在酶解温度50 ℃时其得率达到最高，其中酶解温度对纤维素酶影响较大。这是因为随着温度的升高，分子热运动增强，多糖溶解速度加快，但是当温度继续上升时，多糖得率不断降低，推测是高温使得酶蛋白变性，酶活力减弱，直至完全丧失，多糖得率随之下降。这与蒋德旗等[9]的研究结果相近。

图3 酶解温度对黑松松针多糖得率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.4 酶解时间对黑松松针多糖得率的影响

由图4 可见，随着酶解时间的延长，使用纤维素酶提取的多糖得率受酶解时间的影响较大，酶解2 h时，松针多糖得率最高，推测原因，随着酶解时间的延长，底物组织结构充分破坏，多糖得以释放出来；使用果胶酶提取的松针多糖在酶解1.5 h 时，酶与底物进行充分反应，松针多糖得率较好，随着酶解时间的延长，果胶酶活性下降，部分多糖已破坏，使得多糖得率逐渐降低。这与吴龙月等[10]的研究结果相似。

图4 酶解时间对黑松松针多糖得率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.5 pH 对黑松松针多糖得率的影响

pH 也是影响酶活性的重要因素之一。如图5 所示，使用纤维素酶和果胶酶提取的松针多糖均在pH为6.5 时得率最高，这是因为pH 的升高或降低直接影响酶活性。此外，极酸或者极碱环境会造成多糖中糖苷键的断裂，使得多糖结构遭到破坏[11]。

图5 pH 对黑松松针多糖得率的影响Fig.5 Effect of enzymolysis pH on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.2 正交试验结果

2.2.1 纤维素酶提取黑松松针多糖工艺正交试验结果

采用直观分析法进行数据处理，探究各个因素对松针多糖得率的影响程度，结果如表3 所示。液料比的极差最大，为1.305，表明液料比在黑松松针多糖提取过程中对多糖得率的影响最大，且最佳液料比为20∶1（mL/g）。各因素对黑松松针多糖得率的影响程度依次为：A＞C＞D＞E＞B，纤维素酶提取黑松松针多糖最优条件为 A2B3C2D2E3，即液料比 20∶1（mL/g），纤维素酶添加量2.5%，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h，pH 6.5。通过对最佳工艺条件进行验证试验得到黑松松针多糖得率为4.73%，高出正交试验组的最佳组合。根据纤维素酶提取黑松松针多糖工艺正交试验方差分析结果（表4）可知，液料比对黑松松针多糖得率影响显著（P＜0.05）。

表3 纤维素酶提取黑松松针多糖工艺正交试验的结果Table 3 Results of orthogonal test on polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by cellulase

表4 纤维素酶提取黑松松针多糖工艺正交试验方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by cellulase

2.2.2 果胶酶提取黑松松针多糖工艺正交试验结果

果胶酶提取黑松松针多糖正交试验结果如表5所示。各因素对黑松松针多糖得率的影响程度依次为：C’＞E’＞B’＞D’＞A’，果胶酶提取黑松松针多糖最优条件为即液料比 20∶1（mL/g），果胶酶添加量1.5%，酶解温度50 ℃，酶解时间1.5 h，pH 6.5。通过对最佳组合进行验证试验得出黑松松针多糖得率为3.62%。根据果胶酶提取黑松松针多糖工艺正交试验方差分析结果（表6）可知，酶解温度和pH 是松针多糖提取的显著影响因素（P＜0.05）。

表5 果胶酶提取黑松松针多糖工艺正交试验的结果Table 5 Results of orthogonal test on polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by pectinase

表6 果胶酶提取黑松松针多糖工艺正交试验方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by pectinase

2.3 复合酶法提取黑松松针多糖得率结果

根据上述正交试验结果，同步加酶法是将纤维素酶（酶添加量2.5%）和果胶酶（酶添加量1.5%）按照液料比 20∶1（mL/g），酶解温度 50 ℃，纤维素酶酶解时间2 h、果胶酶酶解时间1.5 h，pH 6.5 条件下提取黑松松针多糖。分步加酶法，即两种酶分别在各自的最适条件（正交的最优条件）下按照先纤维素酶后果胶酶和先果胶酶后纤维素酶的顺序分别加入进行提取。结果如表7 所示。

表7 不同加酶法提取的松针多糖得率Table 7 Results of polysaccharides yied from Pinus thunbergii needles with different enzymatic methods 单位：%

由表7 可见，分步加酶法提取黑松松针多糖的效果优于同步加酶法，与王艳等[12]的研究结果相似，这是由于分步加酶法是在各自酶的最佳反应条件下进行的酶解反应，使得两种酶的酶解效率得到提高，且先加纤维素酶后加果胶酶的顺序提取松针多糖的效果较好，松针多糖得率最高，为6.17%。植物细胞的细胞壁主要由纤维素、果胶等组成，多糖通常包裹在植物细胞壁内，推测先加纤维素酶可以水解松针细胞壁的纤维素，破坏细胞壁结构，促进多糖成分溶出，后加果胶酶对细胞壁进一步进行降解，利于多糖的溶出，还可以降低提取液的黏度。

2.4 抑菌试验结果

由图6 可见，经过纤维素酶和果胶酶酶解提取的黑松松针多糖溶液对大肠杆菌（抑菌圈直径为11.25 mm）和枯草芽孢杆菌（抑菌圈直径为12.78 mm）有较好的抑菌效果。

图6 黑松松针多糖的抑菌效果Fig.6 Bacteriostatic effects of polysaccharide from Pinus thunbergii needles

3 结论

黑松松针的细胞壁构成主要是纤维素、半纤维素、果胶质等，本试验选用纤维素酶和果胶酶，可以更加有效地破坏松针细胞结构，提高多糖成分的提取率。本试验先采用单酶的单因素试验和正交试验，确定单酶提取多糖的最优条件并进行验证试验，再采用复合酶法进行提取研究，证实分步加酶法提取的多糖得率较高。工艺参数为：液料比 20∶1（mL/g），酶解温度50 ℃，pH 6.5，先添加2.5%纤维素酶，酶解时间2 h，后添加果胶酶1.5%，酶解时间1.5 h，该条件下提取的松针多糖得率最高，为6.17%。通过松针多糖的抑菌试验证实该方法提取的黑松松针多糖溶液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有一定的抑制作用。本试验设计的复合酶分步加酶法提取黑松松针多糖提高了多糖得率，并且提取的多糖具有一定的抑菌效果，为植物性生物活性物质的提取和黑松松针多糖的开发利用了提供依据。