茄根含氮类成分及其抗炎活性

2021-03-25杨炳友匡海学

中成药 2021年3期

刘艳，殷鑫，潘娟，管伟，杨炳友，匡海学

(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040）

茄根为茄科植物茄Solanum melongenaL.的干燥根及茎基,是民间常用中药材,具有清热止血、祛风利湿等功效,传统用于治疗冻疮、脚气、血痢、风湿热痹等［1］。茄在世界范围内种植广泛,其果实被作为大众蔬菜食用,然而,每年果实采收的同时会有大量的茄根被丢弃,造成了严重的资源浪费。近年来,越来越多的研究者开始关注茄根的生物活性,发现其在抗炎方面较为突出［2-6］。为了深入探索茄根抗炎的药效物质基础,本实验对茄根乙醇提取物的化学成分进行研究,从中分离得到12 个含氮化合物,所有化合物均为首次从该植物中分离得到。同时,采用LPS 诱导的RAW264.7生成NO 细胞模型评价所得化合物的抗炎活性,化合物4、8、10～12 具有潜在的抗炎活性。

1 材料

Bruker-400 超导核磁共振光谱仪(德国Bruker公司)；ACQUITY Ultra Performance LCTM液质联用色谱仪、Delta 600-2487 型制备HPLC、2695-2998-2414 型分析HPLC、Waters Sunfire C18分析型色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters Sunfire C18制备型色谱柱(19 mm×250 mm,10 μm) (美国Water 公司)；柱色谱用硅胶(200～300 目,青岛海洋化工厂)；MCI 柱色谱反相(日本三菱公司)；YMC ODS-7515-12A 柱色谱反相 (日本YMC 公司)；Sephadex LH-20 柱色谱 (瑞典 GE Life Sciences 公司)；TLC 用硅胶板(Silicagel 60 F254)、反相板(Rp-18 F254) (德国Merck 公司)；所用试剂均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)。

茄根于9 月末采收于河北省安国市,放置通风处阴干。经黑龙江中医药大学药学院药用植物教研室樊锐锋鉴定为茄科茄属植物茄Solanum melongenaL.的干燥根。原植物标本(20161010)保存于黑龙江中医药大学中药化学教研室。

2 提取与分离

干燥茄根(20 kg) 切段后,用70%乙醇回流提取3 次,每次2 h,减压回收溶剂,得浸膏1.503 kg。之后采用MCI 柱色谱法,依次用30%、60%、80%甲醇洗脱,收集各组分洗脱液,回收溶剂,得30%甲醇洗脱组分597 g、60%甲醇洗脱组分403 g、80%甲醇洗脱组分171 g。60%甲醇组分(200 g) 通过硅胶柱色谱,用二氯甲烷-甲醇(1 ∶0～0 ∶1) 梯度洗脱,所得洗脱液经过反复TLC 分析鉴别后合并,最终得到Fr.1～9 共9 个流分。Fr.2 经过ODS 柱甲醇-水(20 ∶80～100 ∶0) 梯度洗脱,获得Fr.2 A～H 共8 个组分。Fr.2C 经过ODS 柱甲醇-水(10 ∶90～100 ∶0) 梯度洗脱,获得Fr.2C1～9 共9 个组分。Fr.2C3 经Sephadex LH-20 柱甲醇-水 (70 ∶30) 洗脱,依次得化合物3(1.2 mg)、7 (8.7 mg)。Fr.2C7 为化合物1 (5.7 mg)。Fr.3 经半制备型HPLC 甲醇-水(20 ∶80～100 ∶0) 获得Fr.3 A～F 共6 个组分。Fr.3B 经半制备型HPLC 甲醇-水(12 ∶88) 得化合物10 (8.6 mg)、11 (4.0 mg)、12 (5.4 mg)。Fr.3D 经过ODS 柱甲醇-水(20 ∶80～100 ∶0) 梯度洗脱,获得Fr.3D1～7 共7 个组分。Fr.3D5 为化合物4(8.3 mg)。Fr.4 经过ODS 柱色谱甲醇-水(20 ∶80～100 ∶0) 梯度洗脱,获得Fr.4 A～H 共8 个组分。Fr.4 A 经半制备型HPLC 甲醇-水(42 ∶58)得到化合物2 (6.5 mg)、8 (6.2 mg)。Fr.4E 经ODS 柱色谱甲醇-水(15 ∶85～100 ∶0) 梯度洗脱,获得Fr.4E1～6 共6 个组分。Fr.4E1 经半制备型HPLC 甲醇-水(54 ∶46) 得化合物5 (15.0 mg)、6 (9.1 mg)。Fr.4E1 经Sephadex LH-20 柱色谱甲醇-水(100 ∶0) 洗脱,获得化合物9 (1.1 mg)。

3 结构鉴定

化合物1:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:180.101 1 ［M+H］+(计算值180.102 5),分子式C10H13NO2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.01 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),6.70 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),2.67(2H,t,J=7.3 Hz,H-7),3.32 (2H,t,J=7.3 Hz,H-8),1.89 (3H,s,H-10)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:131.3 (C-1),130.7 (C-2,6),116.2 (C-3,5),156.9 (C-6),35.7 (C-7),42.4 (C-8),173.0 (C-9),22.5 (C-10)。以上数据与文献［7］基本一致,故鉴定为N-acetyltyramine。

化合物2:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:164.105 1 ［M+H］+(计算值164.107 5),分子式C10H13NO。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.15～7.28 (5H,m,H-2,3,4,5,6),2.77 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),3.37 (2H,t,J=7.6 Hz,H-8),1.89 (3H,s,H-10)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:140.5 (C-1),129.5 (C-2),129.8 (C-3),127.3 (C-4),129.8 (C-5),129.5 (C-6),36.5 (C-7),42.1 (C-8),173.2(C-9),22.5 (C-10)。以上数据与文献［8］基本一致,故鉴定为N-(2-phenylethyl) acetamide。

化合物3:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:164.073 6 ［M+H］+(计算值164.071 2),分子式 C9H10NO2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.41 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),6.43 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),7.47(1H,d,J=15.8 Hz,H-7),6.43 (1H,d,J=15.8 Hz,H-8)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:127.6(C-1),130.7 (C-2),116.7 (C-3),160.7 (C-4),116.7 (C-5),130.7 (C-6),142.9 (C-7),117.8 (C-8),171.7 (C-9)。以上数据与文献［9］基本一致,故鉴定为3-(4-aminophenyl) -prop-2-enoic acid。

化合物4:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:227.140 2 ［M+H］+(计算值227.139 6),分子式C11H18N2O3。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:3.49 (1H,m,H-3a),3.52(1H,m,H-3b),1.91 (1H,m,H-4a),2.02(1H,m,H-4b),1.97 (1H,m,H-5a),2.31(1H,m,H-5b),4.07 (1H,brs,H-6),4.19(1H,d,J=7.2 Hz,H-9),2.16 (1H,m,H-10),1.44 (1H,m,H-11a),1.31 (1H,m,H-11b),0.93 (3H,t,J=7.4 Hz,H-12),1.06 (3H,d,J=7.2 Hz,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:172.4 (C-1),46.2 (C-3),23.2 (C-4),29.6 (C-5),61.3 (C-6),167.6 (C-7),60.0 (C-9),25.4 (C-10),37.1 (C-11),15.5 (C-12),12.6(C-13)。以上数据与文献［10］基本一致,故鉴定为callyspongidipeptide A。

化合物5:白色晶体,易溶于甲醇。HR-ESIMSm/z:222.079 2 ［M+H］+(计算值222.076 6),分子式C11H11NO4。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:8.30 (1H,dd,J=8.4,2.1 Hz,H-2),7.25 (1H,d,J=8.4 Hz,H-3),8.52 (1H,d,J=2.1 Hz,H-6),2.43 (2H,t,J=7.9 Hz,H-3′),1.89 (2H,m,H-4′),3.80 (2H,t,J=7.0 Hz,H-5′)；13CNMR (100 MHz,CD3OD)δ:127.6 (C-1),130.6(C-2),117.8 (C-3),157.9 (C-4),123.5 (C-5),130.2 (C-6),168.6 (C-7),175.4 (C-2′),31.6 (C-3′),19.2 (C-4′),49.8 (C-5′)。以上数据与文献［11］基本一致,故鉴定为pistaciamide。

化合物6:淡黄色晶体,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:325.142 5 ［M+H］+(计算值325.140 0),分子式C15H20N2O6。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.86 (1H,s,H-5),7.06 (1H,s,H-8),2.15 (3H,s,H-9),2.13 (3H,s,H-10),5.36 (1H,dd,J=14.0,9.6,H-1′a),4.91(1H,dd,J=14.0,2.4,H-1′b),5.16 (1H,m,H-2′),4.65 (1H,m,H-3′),4.70 (1H,m,H-4′),4.41 (1H,dd,J=10.6,2.7,H-5′a),4.56(1H,dd,J=10.6,4.5,H-5′b)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:157.8 (C-2),155.4 (C-3),125.2 (C-4a),118.0 (C-5),132.6 (C-6),132.1 (C-7),117.1 (C-8),126.6 (C-8a),20.0(C-9),19.5 (C-10),46.9 (C-1′),71.6 (C-2′),75.7 (C-3′),75.1 (C-4′),65.6 (C-5′)。以上数据与文献［12］基本一致,故鉴定为tatarine C。

化合物7:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:243.099 5 ［M+H］+(计算值243.098 1),分子式C10H14N2O5。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.80 (1H,s,H-4),1.87 (3H,s,H-7),6.27 (1H,t,J=7.0 Hz,H-1′),2.23(2H,m,H-2′),4.39 (1H,m,H-3′),3.90 (1H,brd,J=3.4,H-4′),3.72 (1H,dd,J=12.0,3.4,H-5′a),3.79 (1H,dd,J=12.0,3.6,H-5′b)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:166.4 (C-2),111.5 (C-3),138.1 (C-4),152.3 (C-6),12.4(C-7),86.2 (C-1′),41.1 (C-2′),72.2 (C-3′),88.8 (C-4′),62.8 (C-5′)。以上数据与文献［13］基本一致,故鉴定为thymidine。

化合物8:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:186.117 7 ［M+H］+(计算值186.113 0),分子式 C9H15NO3。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:2.33 (2H,m,H-3),2.48 (1H,m,H-4a),2.14 (1H,m,H-4b),4.27 (1H,dd,J=9.1,4.4 Hz,H-5),4.16 (2H,t,J=6.6,H-7),1.64 (2H,m,H-8),1.40 (2H,m,H-9),0.95 (3H,t,J=7.4,H-10)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:174.1 (C-2),30.3 (C-3),25.9 (C-4),57.1 (C-5),181.0 (C-6),66.3 (C-7),31.7 (C-8),20.1 (C-9),14.0 (C-10)。以上数据与文献［14］基本一致,故鉴定为butyl-2-pyrrolidone-5-carboxylate。

化合物9:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:119.062 8 ［M+H］+(计算值119.060 9),分子式C7H6N2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.93 (1H,s,H-3),8.06 (1H,dd,J=6.8,1.5 Hz,H-4),7.16 (1H,m,H-5),7.19 (1H,m,H-6),7.42 (1H,dd,J=6.8,1.5 Hz,H-7)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:133.4 (C-3),122.4 (C-4),122.0 (C-5),127.6(C-6),112.9 (C-7),138.2 (C-8),123.6 (C-9)。以上数据与文献［15］基本一致,故鉴定为indazole。

化合物10:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:211.141 8 ［M+H］+(计算值211.144 7),分子式C11H19N2O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:3.50 (2H,m,H-3),1.87 (1H,m,H-4a),2.01 (1H,m,H-4b),2.29 (1H,m,H-5a),1.92 (1H,m,H-5b),4.12 (1H,m,H-6),4.26 (1H,t,J=6.8,H-9),1.98 (1H,m,H-10a),1.51 (1H,m,H-10b),1.98 (1H,m,H-11),0.96 (3H,d,J=6.4,H-12),0.94 (3H,d,J=6.2,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:172.8 (C-1),46.4 (C-3),23.7 (C-4),29.1 (C-5),60.3 (C-6),168.9 (C-7),54.6 (C-9),39.4 (C-10),25.8 (C-11),23.3 (C-12),22.2(C-13)。以上数据与文献［10］基本一致,故鉴定为cyclo-［(S) -pro-(R) -leu］。

化合物11:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:214.150 8 ［M+H］+(计算值214.155 6),分子式C10H20N3O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:3.60 (1H,m,H-3a),3.49(1H,m,H-3b),2.02 (1H,m,H-4a),1.93(1H,m,H-4b),2.32 (1H,m,H-5a),1.95(1H,m,H-5b),4.02 (1H,br.s,H-6),4.19(1H,t,J=7.6,H-9),2.47 (1H,m,H-10),1.08 (3H,d,J=7.2,H-11),0.92 (3H,d,J=6.9,H-12)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:172.6(C-1),46.2 (C-3),23.3 (C-4),29.5 (C-5),61.5 (C-6),167.6 (C-7),60.0 (C-9),29.9 (C-10),18.8 (C-11),16.7 (C-12)。以上数据与文献［10］基本一致,故鉴定为seco-［(S) -pro-(R) -val］。

化合物12:无定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:245.130 0 ［M+H］+(计算值245.129 0),分子式C14H17N2O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:3.36 (1H,m,H-3a),3.52(1H,m,H-3b),1.79 (2H,m,H-4),1.22 (1H,m,H-5a),2.08 (1H,m,H-5b),4.06 (1H,ddd,J=10.7,6.3,1.7,H-6),4.44 (1H,ddd,J=9.8,4.9,1.7,H-9),3.13 (1H,dd,J=14.2,4.8,H-10a),3.18 (1H,dd,J=14.2,5.2,H-10b),7.24 (5H,m,H-2′～6′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:166.9 (C-1),46.0 (C-3),22.8(C-4),29.4 (C-5),60.1 (C-6),170.9 (C-7),57.7 (C-9),38.2 (C-10),137.3 (C-1′),131.1(C-2′),129.5 (C-3′),128.1 (C-4′),129.5 (C-5′),131.1 (C-6′)。以上数据与文献［16］基本一致,故鉴定为(L) -pro-(L) -phe。

4 抗炎活性测试

采用LPS 诱导RAW264.7 生成NO 的细胞模型评价化合物1～12 的抗炎活性,吲哚美辛作为阳性药。RAW264.7 细胞接种于96 孔板中,加入1 μg/mL LPS 刺激,孵育后加入充分溶解的各浓度药物(终浓度为1、5、10、20、40、80 μmol/L),孵育后转移上清液至新96 孔板,分别加入Griess试剂A、B 液各50 μL,避光显色15 min,570 nm下用酶标仪测各孔吸光度(OD) 值,计算其半数抑制浓度(IC50) 实验重复3 次,结果见表1。

表1 各化合物对LPS 诱导RAW264.7 生成NO 的抑制率（，μmol/L）Tab.1 Inhibition rate of various compounds on LPS-induced NO production by RAW264.7（，μmol/L）