一株嗜盐脱硫菌的筛选及其脱硫特性的研究*

张海林 秦子臻 邢壮壮 葛大艳 李 柳 张 然 张玉然

（济宁医学院生物科学学院 山东日照 276826）

随着环保要求的不断提高，作为清洁能源的生物质气体（沼气、天然气、填埋气等）备受人们青睐。而生物质气体中常含有不同浓度的H2S 气体（1～12 g/m3）[1]。酸性的H2S 气体容易腐蚀输送管道、燃烧设备及发电装置，燃烧后亦会产生污染性的酸性气体SO2，因此，在利用之前须被脱除。

去除H2S 的方法主要有化学法和生物法。生物法工艺因具有运行条件温和、去除H2S 效率高、运行成本低，不产生二次污染等优点[2-3]，被广泛应用于生物质气体脱硫领域中。在众多的生物脱硫工艺中，Shell-Paques 碱法生物脱硫工艺具有运行性能稳定、较强的抗H2S 负荷冲击力等特点[4]，被大量应用于沼气脱硫领域。Shell-Paques碱法工艺为分段式，在吸收塔内利用碱性液体吸收生物质气体中的H2S，而后在反应器中进行生物氧化，同时完成碱性液体再生，整个过程周而复始连续进行，终产物主要为单质硫，并伴有副产物S2O32-和SO42-的生成。系统运行过程中，碱性液体的碱度基本维持恒定，而酸性副产物的积累常会导致体系中钠盐浓度升高，而当Na+离子浓度达到0.85 mol/L 时，S2-去除速度显著被抑制。为了降低Na+离子浓度，需大量更换反应器中的碱性液体，浪费大量液碱，增加脱硫成本。因此，筛选嗜盐性强、脱硫性能优越的菌株势在必行。

本研究拟从晒盐场污泥里筛选1 株嗜盐脱硫菌株，并通过分子生物学方法对其进行鉴定，而后对其Na+浓度耐受性、最佳环境pH 值和温度进行探索，最后，比较了以氧化还原电位和溶解氧为过程控制指标时的脱硫效果，为解决碱法生物脱硫工艺中碱耗过高的问题提供理论研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1）菌株筛选样品来源：中国寿光海化集团卤水晒盐场底层10～20 cm 处污泥。

2）培养基：

液体富集培养基：NaHCO350 g/L、Na2S2O3·5H2O 50 g/L、（NH4）2SO41 g/L、KNO31 g/L、K2HPO42 g/L、自然pH 值。

高盐筛选培养基：NaHCO350 g/L、Na2S2O3·5H2O 50 g/L、（NH4）2SO41 g/L、KNO31 g/L、K2HPO42 g/L、Na2SO450 g/L、琼脂20 g/L、自然pH 值。

基础培养基：NaHCO350 g/L、（NH4）2SO41 g/L、KNO31 g/L、K2HPO42 g/L、自然pH 值。

3）仪器与试剂：PCR 仪S1000（美国伯乐公司）、Gel Doc EZ Imager（美国伯乐公司）、Eppendorf BioFlo 7.5 L 发酵罐、细菌基因组DNA 提取试剂盒（上海生工）等。

1.2 方法

1）液体富集培养：取晒盐场污泥，按重量比1∶3 加无菌水悬浮，无菌脱脂棉过滤，过滤液在8 000 r/min，离心5 min，将沉淀物转移至液体富集培养基中，36℃、200 r/min 震荡培养2 d。

2）嗜盐脱硫菌的筛选：富集菌液稀释适当比例，涂布于高盐筛选培养基，36℃培养3～7 d，挑选菌落较大、菌落周边有明显单质硫沉积的菌株，并将其命名为ZTLH 菌株。

3）脱硫菌种的分子生物学鉴定及系统发育树构建：参照文献方法[5]，对16S rDNA 进行扩增，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，使用MEGA 7.0 软件同源比对，并构建系统进化树。

4）Na+浓度对ZTLH 菌株去除S2-速度的影响：向含有90 mmol/L Na2S 的基础培养基中添加固体Na2SO4，至Na+离子浓度分别为1.0 mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L、1.6 mol/L、1.8 mol/L、2.0 mol/L，将富集培养基培养24 h 的菌体离心、接种于该培养基中，36℃、200 r/min 震荡培养12 h，间隔1 h 取样测定S2-残留量，以未加脱硫菌种的基础培养基为空白对照。

5）环境pH 值对H.kellyZTLH 菌株去除S2-速度的影响：将菌种接种于不同pH 值（8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5）的含有90 mmol/L Na2S 的基础培养基中（Na+为1.8 mol/L），36℃、200 r/min 震荡培养12 h，间隔1 h 取样，测定S2-残留量。

6）环境温度对ZTLH 菌株去除S2-速度的影响：将菌种接种于含有90 mmol/L Na2S 基础培养基中（Na+为1.8 mol/L，pH=9.0），于不同温度（30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃），200 r/min 震荡培养12 h，间隔1 h 取样，测定S2-残留量。

7）DO/ORP 控制策略对ZTLH 菌株脱硫性能的影响：将菌种接种于液体富集培养基中（共计4 L），36℃、200 r/min 震荡培养24 h，离心获得菌体，并接种于4 L 基础培养基中（含Na+1.8 mol/L）。在7.5 L eppendoff 发酵罐内，通风比1∶1（v/v），39℃条件下，根据溶解氧（DO）、氧化还原电位（ORP）控制参数值，调控Na2S 的流加速度，每次实验周期为72 h，测定反应体系内S2-、S、S2O32-、SO42-等离子含量。

8）分析方法：S2-离子分析方法采用碘量法；SO42-离子分析方法采用铬酸钡比色法[6]；S2O32-离子分析方法采用紫外分光光度法[7]；单质硫分析方法采用称重法和质量守恒法[6]。

2 结果和分析

2.1 嗜盐脱硫菌筛选及分子生物学鉴定 从海化集团卤水晒盐场污泥中筛选出1 株嗜盐脱硫菌株ZTLH，经平板培养后，菌落周围有明显单质硫沉积，且颜色由白色逐渐变为褐色。利用通用引物扩增其16S rDNA 序列，并进行测序分析，构建系统发育进化树，结果如图1所示。菌株ZTLH 与Halothiobactllus kellystrain BII-1 亲缘关系较近，聚成一支，结合NCBI 数据库显示与其相似度高达99.0%，进一步将该菌株命名为Halothiobactllus kellyZTLH。

图1 H.kelly ZTLH 菌株16S rDNA 序列PCR 扩增产物电泳图（a）和构建的系统发育进化树（b）

2.2 Na+浓度对菌株H.kellyZTLH 脱硫速度的影响 在不同浓度Na+条件下，研究其对H.kellyZTLH 脱除S2-速度的影响，结果如图2所示。当培养基中Na+浓度低于1.8 mol/L 时，均不影响H.kellyZTLH 对S2-的脱除率。与已报道的脱硫微生物在0.85 mol/L Na+浓度下，S2-去除速度即会显著下降[6,8]相比，H.kellyZTLH 具有优良的Na+耐受性。

图2 Na+浓度对H.kelly ZTLH 菌株去除S2-速度的影响

2.4 环境pH 对H.kellyZTLH 菌株脱硫速度的影响 调整不同的环境pH 值，研究其对H.kellyZTLH 菌株去除S2-速度的影响，结果如图3所示。培养基pH 值低于10.5 时，均不影响H.kellyZTLH对S2-的脱除率，而环境pH 值高于11.0 时，S2-去除速度受到明显抑制。H.kellyZTLH 具有高浓度Na+耐受性同时，亦可耐受较高的环境pH 值。

图3 环境pH 值对H.kelly ZTLH 菌株去除S2-速度的影响

2.5 环境温度对ZTLH 菌株脱硫速度的影响 调整不同的培养环境温度，研究其对H.KellyZTLH菌株代谢S2-速度的影响，结果如图4所示。H.kellyZTLH 菌株最适培养温度为36～39℃。过低（33℃以下）或过高的环境温度（42℃以上）均会降低去除S2-的速度。

图4 温度对H.kelly ZTLH 菌株去除S2-速度的影响

2.6 DO/ORP 控制策略对脱硫性能的影响 在减法生物脱硫工艺中，S2-被脱硫微生物氧化后的产物一般为S、S2O32-、SO42-。S 在总硫中的占比，是决定脱硫运行成本的关键因素。溶解氧（DO）、氧化还原电位（ORP）是影响代谢产物成分的关键控制参数。按1.2.方法7 中所述方法，研究其对H.kellyZTLH 菌株去除S2-速度及脱硫产物的影响。

当DO 浓度从0.5 mg/L 提高至1.5 mg/L 时，S2-去除速度由12.5 mmol/（L·h）增加至25.2 mmol/（L·h），而单质硫生成比例却由93.4%下降至75.3%，同时、SO42-生成比例分别增加了3 倍和10 倍（图5）。当DO 浓度高于1.0 mg/L 时，S2-去除速度小幅度提高，而单质硫生成比例却大幅降低。为了获得较高的单质硫生成比例，DO 浓度应控制在1.0 mg/L 以内。

图5 溶解氧（DO）对H.kelly ZTLH 菌株去除S2-速度及脱硫产物的影响

在ORP 控制策略中，随着ORP 值的降低，S2-去除速度由26.1 mmol（/L·h）降低至19.5 mmol（/L·h），降低幅度较小，而单质硫生成比例由80.4%大幅升高至93.5%，同时S2O32-、SO42-生成比例都分别减少了2 倍（图6）。ORP 控制值对S2-去除速度影响较小，而对单质硫生成比例影响较大，最佳ORP控制范围为-380～-375 mV。

脱硫微生物氧化低价硫元素（S2-）过程中，普遍同时存在氧化产物为单质硫的辅酶Q 途径和氧化产物为S2O32-、SO42-的细胞色素途径[9-10]。这2 种途径分别受到细胞内的能荷量、氧浓度、S2-浓度调节[11]。较高的细胞内氧浓度能激活细胞色素途径相关酶活性，导致较多的S2-过度氧化至S2O32-、乃至SO42-；而较高的细胞内S2-浓度能抑制细胞色素途径相关酶活性[12]，激发辅酶Q 途径，S2-被有限地被氧化至单质硫。对于H.kellyZTLH 菌株，ORP 控制策略明显优于DO 控制策略，这可能与ORP 控制方式下，溶液中较高的S2-浓度部分抑制细胞色素途径有关。

3 结论

本文通过高盐筛选培养基筛选，获得一株嗜盐性能优良的脱硫菌株，经序列比对和进化树综合分析，鉴定属于Halothiobactllus kelly菌属。H.kellyZTLH 菌株能耐受1.8 mol/L Na+极端环境，并在高盐环境下S2-去除速度达到20～25 mmol/（L·h）。相比于DO 控制策略，在ORP 控制方式下，脱硫产物中单质硫占比可达93.5%。H.kellyZTLH 菌株具有较高的S2-去除速度，有助于缩小碱法生物脱硫工艺中体积较大的反应器体积；良好的耐盐性能和脱硫产物中单质硫占比，有助于解决目前碱法生物脱硫工艺中存在的碱耗过高和易染杂菌的问题。