马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp70的克隆及温度胁迫下的表达特性

2021-03-25郑海霞高玉林张方梅杨超霞蒋健朱勋张云慧李祥瑞

中国农业科学 2021年6期

郑海霞, 高玉林, 张方梅,3, 杨超霞,, 蒋健, 朱勋, 张云慧, 李祥瑞

马铃薯甲虫热激蛋白基因的克隆及温度胁迫下的表达特性

郑海霞1, 高玉林2, 张方梅2,3, 杨超霞1,2, 蒋健2, 朱勋2, 张云慧2, 李祥瑞2

1山西农业大学植物保护学院，山西太谷 030801；2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3信阳农林学院农学院，河南信阳 464000

【】热激蛋白（heat shock protein，HSP）是一种在生物体内广泛存在且高度保守的蛋白质，在生物抗逆过程中发挥重要作用。当生物体遭受不利环境条件胁迫时，其迅速产生可保证生物体的正常生理活动。本研究以重大检疫害虫马铃薯甲虫（）为研究对象，对其热激蛋白HSP70基因（）进行克隆，并对其在温度胁迫下的表达特性进行分析，明确HSP70在马铃薯甲虫温度胁迫中的作用。基于NCBI数据库检索筛选马铃薯甲虫HSP70的cDNA序列，利用RT-PCR和RACE技术对的全长cDNA进行克隆；利用DNAMAN软件对其全长序列进行拼接；采用生物信息学方法对及其编码氨基酸的序列特性进行分析；使用MEGAX软件的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建马铃薯甲虫HSP70与其他昆虫HSP70的系统进化树；利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对在不同温度胁迫条件下的表达模式进行分析；利用Primer 5.0软件设计试验所用的特异性引物。基于NCBI数据库获得3类马铃薯甲虫HSP70 cDNA序列，分别命名为HSP70a、HSP70b和HSP70c，经克隆、拼接获得其全长序列，分别命名为、和，GenBank登录号分别为KC544268、KC544269和KC544270。序列分析表明，3个编码的氨基酸序列均包含了完整保守结构域和3段保守的HSP70家族签名序列，且在氨基酸C末端具有保守的亚细胞定位基序。和的氨基酸C末端具有保守基序EEVD，属于胞质型热激蛋白；的氨基酸C末端具有保守基序KDEL，属于内质网型热激蛋白。系统进化树分析显示，和与其他物种的HSP70分别聚为一支，与已报道的马铃薯甲虫HSP70聚为一支。其中，与龟纹瓢虫（）的，与稻水象甲（）的，与大猿叶甲（）的同源性最高。qRT-PCR结果表明，高、低温均能诱导马铃薯甲虫雌、雄成虫的3个的表达。不同温度胁迫处理1 h后，马铃薯甲虫雌、雄成虫体内3个的相对表达量未见显著变化；而4 h后，马铃薯甲虫雌、雄成虫的相对表达量与对照相比分别在低温-10℃和高温44℃时显著上调至2.24和2.41倍，和相对表达量在胁迫4 h后与对照相比差异均不显著。另外，无论是雌虫还是雄虫，3个的相对表达量在同一温度不同的胁迫处理时间之间均无显著差异。可以响应高、低温胁迫，可能在马铃薯甲虫抵御温度胁迫中发挥作用，而和对高、低温均不敏感，表明马铃薯甲虫3个在抗温度胁迫中发挥不同的作用。

马铃薯甲虫；温度胁迫；热激蛋白70；表达谱

0 引言

【研究意义】马铃薯甲虫（）是鞘翅目（Coleoptera）叶甲科（Chrysomelidae）的一种世界公认的毁灭性害虫，是我国重大检疫对象之一。该虫以成虫、幼虫危害马铃薯（）、茄子（）和番茄（）等多种茄科植物的茎叶、花蕾等部位[1-2]，同时传播马铃薯褐斑病菌和环腐病菌等，造成马铃薯产量的重大损失[3-4]。马铃薯甲虫成虫不仅具有自主扩散能力[5-6]，还对温度[7]、杀虫剂[1]等有着极强的抵抗力，成为了亚洲、欧洲、北美等地茄科植物的重要害虫[1]。温度是影响物种种群扩散和分布的重要因素[8]，大量研究也证实马铃薯甲虫具有很强的耐寒性和耐高温能力，与其发育起点温度、有效积温、发育历期、繁殖力及扩散等都有着直接的关系[9-12]。因此，研究马铃薯甲虫对温度胁迫的响应机制对其科学防控具有重要意义。【前人研究进展】热激蛋白（heat shock protein，HSP）是一种在生物体内广泛存在的抗逆蛋白，在进化上高度保守。当生物体遭受不利环境条件胁迫时，其迅速产生可保证生物体的正常生理活动[13]。由于热激蛋白分子量大小不同，一般将其分为4个家族，分别为HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP家族[14-15]。其中HSP70家族是最为保守的一类，存在于原核生物和真核生物体的所有细胞区室和器官中。一般情况下，HSP70以稳定态存在于细胞浆内，在应激环境下，会迅速转移到细胞核内，表达也迅速增加，仅有少量存在于细胞浆内；当应激刺激消失，细胞恢复正常状态，核内的HSP70会迅速消失，而细胞浆内仍有低水平的表达[16]。HSP70家族包括两种蛋白质：组成型热激蛋白70（HSC70）和诱导型热激蛋白70（HSP70），组成型热激蛋白在正常环境下表达，不受外界因素的胁迫；而诱导型热激蛋白在温度等胁迫因子处理后，表达量急剧上升[17]。HSP70作为热激蛋白家族中研究最广泛、深入的一类，在生物体高、低温胁迫中起着至关重要的作用[18-20]。国内外对多种昆虫的HSP70基因序列及其在温度胁迫下的表达做了大量的研究。例如，高温处理南美斑潜蝇（）[21]、梨小食心虫（）[22]和空心莲子草叶甲（）[23]等均可显著提高HSP70基因的表达及昆虫的耐热性。不同龄期的赤拟谷盗（）在40℃高温处理1 h后，HSP70基因表达比对照增加了1.1—2.0倍[24]。在低温胁迫下，HSP70在昆虫耐受性中同样挥发作用。例如，黑腹果蝇（）在-7℃处理1 h后，HSP70基因的相对表达量显著上升[25]。褐飞虱（）在高温胁迫下HSP70基因的表达量未发生改变，而低温胁迫下其表达量明显下降[26]。此外，HSP70不同亚族基因在相同温度胁迫下表达模式也存在差异。比如三叶斑潜蝇（）的在高、低温胁迫下表达量均能显著增高，而和对温度的胁迫不敏感，在受到温度胁迫后其表达量无显著变化[27]。褐飞虱HSP70家族的不同基因对高、低温胁迫也表现出不同的响应模式[28]。【本研究切入点】本团队前期已研究了马铃薯甲虫HSP90和HSP60在高温和低温胁迫下的表达特点，表明二者可能在马铃薯甲虫高温胁迫下发挥作用[29-30]。但是不同的HSP基因在抵抗温度胁迫时作用机制不同，有关马铃薯甲虫HSP70基因（）的温度胁迫作用还有待探究。【拟解决的关键问题】利用生物信息学分析方法、RT-PCR及RACE技术，对的全长基因进行克隆、分析，同时结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测马铃薯甲虫雌、雄成虫在高、低温胁迫条件下的表达情况，探讨在温度胁迫中的作用，为明确马铃薯甲虫适应温度响应的机制及其科学防控提供理论依据。

1 材料与方法

试验昆虫的采集分别于2012年6月和2018年6月在新疆农业科学院植物保护研究所安宁渠试验基地马铃薯试验田完成；试验昆虫的处理及解剖于2018年6月在新疆农业科学院植物保护研究所完成；基因克隆试验于2012年、其余所有试验于2018—2019年在中国农业科学院植物保护研究所完成。

1.1 试验昆虫

马铃薯甲虫试验种群采自于新疆农业科学院植物保护研究所安宁渠试验基地马铃薯试验田（87°28′28¢¢E，43°57′7¢¢N）。采回当地实验室后，在室温（25℃）条件下，置于圆柱形养虫盒内（直径12 cm，高12 cm）饲养，养虫盒内放入新鲜的马铃薯叶片，利用纱布网封口保证透气。温度处理时，将马铃薯甲虫雌、雄成虫分别取出，放入铺有马铃薯叶片的培养皿（直径9 cm）中，每皿10只，置于不同设置温度的培养箱中进行处理，设定温度分别为-10、0、38和44℃，处理时间为1和4 h，每个处理重复3次，以室温（25℃）作为对照。处理完成后，将马铃薯甲虫迅速取出，用解剖刀切成厚度不超过0.5 cm的组织块，放入含有RNAlater的1.5 mL离心管中，于4℃冰箱中过夜，保证RNAlater全部浸透组织，最后置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 试剂及仪器

主要试剂：TRIzol试剂盒和M-MLV反转录酶购于美国Invitrogen公司；3¢Full RACE Core Set Ver. 2.0试剂盒、dNTP、Taq酶和SYBR Premix Ex TaqTM购于大连TaKaRa公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于德国OMEGA公司；克隆载体pEASY-T1、感受态细胞Trans1-T1和DNA marker购于法国Transgene公司。引物合成与测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。

主要仪器：ND-2000微量分光光度仪（美国Thermo Scienfic公司）；PCR仪536-TouchGene®Gradient（英国EDVOTEK公司）；实时荧光定量PCR仪7500 Fast（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 马铃薯甲虫总RNA的提取及一链cDNA的合成用Trizol法抽提马铃薯甲虫的总RNA，用微量分光光度仪检测总RNA的浓度，2%的琼脂糖凝胶电泳进一步检测其质量。最后，根据M-MLV反转录试剂盒的操作说明书合成cDNA第一链。

1.3.2 马铃薯甲虫HSP70基因片段的筛选及克隆在NCBI库中检索筛选马铃薯甲虫HSP70的cDNA序列，共检索到3类，分别命名为HSP70a、HSP70b和HSP70c。利用Primer 5.0软件设计特异性引物，引物序列及对应的PCR退火温度见表1。通过多轮PCR扩增获得马铃薯甲虫HSP70的序列片段。具体PCR反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃充分延伸10 min。利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收纯化，再连接到pEASY-T1载体中，转化至Trans1-T1感受态细胞，最后进行菌落PCR阳性克隆鉴定，送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序验证序列的准确性。

表1 试验所用引物

1.3.3 马铃薯甲虫HSP70的全长序列扩增根据1.3.2验证的马铃薯甲虫HSP70的cDNA片段，设计3个的特异性引物（表1），进行3′ RACE扩增获得HSP70的全长序列，具体按照试剂盒说明书中的操作完成。

1.3.4在温度胁迫下的表达提取不同温度处理下的马铃薯甲虫雌、雄成虫的总RNA，取1 μg进行反转录合成cDNA第一链。将反转录的cDNA稀释10倍作为模板，用于qRT-PCR反应。以室温（25℃）作为对照，每个处理重复3次，每次取3头整虫提取总RNA混样，每个样品重复3次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶GADPH（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase）和-微管蛋白TUB（alpha-tubulin）基因作为内参基因[28]，用于qRT-PCR的引物和内参特异性引物见表1。具体qRT-PCR反应条件为95℃预变性30 s；95℃变性3 s，60℃退火与延伸30 s，40个循环；最后在60℃收集荧光信号。采用2-ΔΔCt法计算的相对表达量。

1.4 序列和数据分析

利用DNAMAN软件对马铃薯甲虫HSP70的全长序列进行拼接，然后输入NCBI数据库进行Blast比对分析。利用Biology WorkBench（http://workbench.sdsc. edu/）在线工具获得基因完整的开放阅读框；利用Compute pI/Mw tool（http://web.expasy.org/compute_pi/）预测蛋白质的等电点和分子量。利用ClustalW软件对马铃薯甲虫与其他昆虫HSP70基因序列进行同源性比对，利用MEGAX软件构建neighbor-joining（NJ）系统进化树（bootrap重复1 000次），最后采用FigTree软件（v1.4.3）对系统发育树进行标记。利用SWISS- MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）进行蛋白三维结构的预测，结合PyMOL软件对三维结构进行编辑与输出。

利用SAS9.2（SAS Insitute Inc.，Cary，NC，美国）软件，采用单因素方差（One-way，ANOVA，LSD分析法）分析相对表达量在不同温度胁迫下的差异显著性；并采用独立样本检验（-test）分析相对表达量在某一胁迫温度下不同处理时间之间的差异显著性。

2 结果

2.1 Ld-hsp70的克隆

通过在NCBI数据库中检索比对，获取3个马铃薯甲虫的HSP70a片段，分别设计特异性引物对hsp70aF1和hsp70aR1，hsp70aF2和hsp70aR2，hsp70aF3和hsp70aR3，得到了长度分别为316、297和322 bp的3个片段。进而设计特异性引物hsp70aF4和hsp70aR4，以合成的cDNA为模板，进行第2轮PCR扩增，获得了长度为807 bp的片段。以hsp70aF2和hsp70aR3配对，进行第3轮PCR扩增，获得了一段长1 071 bp的片段，确定为HSP70a的5¢端全长序列（图1-A）。接着，以3¢RACE的cDNA为模板，以hsp70aF3和3¢RACE Inner Primer配对，进行3¢RACE扩增，获得一段长为611 bp的3¢端全长序列（图1-B）。最后设计特异性引物扩增，得到编码ORF区域的全长序列为1 947 bp（图1-C）。该全长序列的5′ UTR长92 bp，3′ UTR长160 bp，将其命名为，提交NCBI数据库，登录号为KC544268。马铃薯甲虫HSP70b全长cDNA序列的克隆过程同上（图1-D—F）。最后获得长度为2 397 bp的HSP70b全长cDNA序列，其ORF长1 974 bp，5′ UTR长132 bp，3′ UTR长291 bp，将其命名为，NCBI登录号为KC544269。马铃薯甲虫HSP70c全长cDNA序列的克隆过程同上（图1-G—I）。最后经DNAMAN软件拼接后得到了长度为2 482 bp的全长cDNA序列，其ORF长1 890 bp，5′ UTR长289 bp，3′ UTR长303 bp，将其命名为，NCBI登录号为KC544270。

2.2 Ld-hsp70序列分析

、和的开放阅读框分别编码648、657和629个氨基酸，3′端非翻译区含有PolyA尾及多聚腺苷酸信号序列AATAAA。预测蛋白相对分子量分别为71.07、72.86和68.72 kD，等电点分别为5.33、5.06和5.58。3个HSP70序列中均具有HSP70家族3段完整的签名序列，分别为GIDLGTTYSCV、FDLGGGTFDVS、VLVGGSTRIPK，说明此3种蛋白属于HSP70家族和的氨基酸C末端序列为EEVD，表明该蛋白质具有胞质型热激蛋白氨基酸特征；的氨基酸C末端序列为KDEL，表明该蛋白质具有内质网型热激蛋白氨基酸特征，属于内质网型热激蛋白。此外，的C末端具有两个GGXP四肽序列，而和C末端均无该序列（图2）。

序列比对发现，、和三者之间的氨基酸序列相似性为71.50%。与的氨基酸序列相似性为71.85%，而与与的序列相似性分别为59.26%和56.50%。将3个HSP70的氨基酸序列与已报道的两个马铃薯甲虫的HSP70（GenBank登录号分别为AF288978和AF322911）氨基酸序列进行比对，其序列相似性为70.94%（图2）。

利用SWISS-MODEL工具建模，以家牛（）的HSC70为模板（PDB登录号：3c7n），预测和编码蛋白的三维结构（图3-A、3-C），以家牛的HSC70为模板（PDB登录号：1yuw），预测编码蛋白的三维结构（图3-B）。结果表明，马铃薯甲虫3个HSP70的三维结构与已知其他物种的HSP70相似度很高，3个HSP70蛋白N端44 kD的片段内含有4个域形成两瓣，两瓣中间形成一个深槽，该区域包含高度保守的ATPase功能域（ATP binding domain）；靠近C端18 kD保守的肽结合域（peptide binding domain），由两个四联反向平行的-折叠和一个-螺旋组成。

2.3 系统发育树分析

选取来自于膜翅目、双翅目、鳞翅目、鞘翅目等昆虫的38个HSP70基因和马铃薯甲虫的5个HSP70基因构建系统系发育树（图4）。结果表明，马铃薯甲虫5个HSP70分别聚类到三大支，和与其他物种的HSP70分别独聚为一支，与已报道的马铃薯甲虫两个HSP70聚为一支，进化距离较近，与和的进化距离较远。

与其他物种比较，与龟纹瓢虫（）的聚为一支，同源性最高，与稻水象甲（）的同源性最高，与大猿叶甲（）的同源性最高。膜翅目、双翅目、鳞翅目、鞘翅目也都能各自聚类。该聚类结果能将昆虫归类到各自传统的分类地位中，说明HSP70可以作为系统进化分析的参照基因。

A：Ld-HSP70a筛选片段的PCR产物PCR product of Ld-HSP70a fragment；B：3′ RACE产物PCR product of 3′ RACE；C：全长ORF的PCR产物PCR product of full-length ORF；D：Ld-HSP70b筛选片段的PCR产物PCR product of Ld-HSP70b fragment；E：3′ RACE产物PCR product of 3′ RACE；F：全长ORF的PCR产物PCR product of full-length ORF；G：Ld-HSP70c筛选片段的PCR产物PCR product of Ld-HSP70c fragment；H：3′ RACE产物PCR product of 3′ RACE；I：全长ORF的PCR产物PCR product of full-length ORF；M1：100 bp ladder DNA maker；M2：BM2000 DNA maker；1—9（箭头Arrow）： PCR 产物 PCR products

HSP70蛋白来源及GenBank登录号 Origin of HSP70 protein and their GenBank accession numbers：马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineataLd-hsp70a（KC544268）；Ld-hsp70b（KC544269）；Ld-hsp70c（KC544270）；LdHSP70A（AF288978）；LdHSP70B（AF322911）。下划线：3段保守的HSP70家族签名序列Underlined: three conserved motifs of the HSP70 family；方框：胞质型标志性基序（EEVD）和内质网型HSPC末端标志性基序（KDEL）Box: the cytoplasmic HSP70 carboxyl terminal region (EEVD) and the endoplasmic reticulum HSP70 carboxyl terminal region (KDEL)；箭头：C末端具有两个GGXP四肽序列Arrows: two GGXP quaternary peptide sequences at the c-terminal；黑色区域：高度保守的氨基酸Black blocks: highly conserved amino acids

A: Ld-hsp70a; B: Ld-hsp70b; C: Ld-hsp70c

蓝色blue：鞘翅目Coleoptera；绿色green：鳞翅目Lepidoptera；黄色Yellow：双翅目Diptera；红色red：膜翅目Hymenoptera。星号*标注为本文中的3个HSP70 Asterisks* are three HSP70s in this study。HSP70s选取的物种来源及其在GenBank中的登录号Origin species of HSP70s and their accession numbers in GenBank：鳞翅目Lepidoptera：天蚕Antheraea yamamai（BAD18974），家蚕Bombyx mori（BAF69068），细纹夜蛾Spodoptera litura（ADV03160），粉茎螟Sesamia nonagrioides（ABZ10939），玉米夜蛾Helicoverpa zea（ACV32640），小菜蛾Plutella xylostella（ADK94697），蒲氏钩蝠蛾Thitarodes pui（ADA61012），二化螟Chilo suppressalis（ADE05296），玉米螟Ostrinia furnacalis（ADR00357），落叶松毛虫Dendrolimus superans（ABM90551），黎豆夜蛾Anticarsia gemmatalis（ADO32621），球菜夜蛾Agrotis ipsilon（AEG78288），甘蓝夜蛾Mamestra brassicae（BAF03556），印度谷螟Plodia interpunctella（ABM88156），粉纹夜蛾Trichoplusia ni（ABH09735），草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（AAN86047）；鞘翅目Coleoptera：空心莲子草叶甲Agasicles hygrophila（KF792067），黄粉虫Tenebrio molitor（JQ219848，JQ219849），谢氏宽漠王Mantichorula semenowi（GU289400），光滑鳖甲Anatolica polita borealis（EF569673），稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus（KC620437，KC620428），龟纹瓢虫Propylea japonica（KJ483960），大猿叶甲Colaphellus bowringi（KF214746），赤拟谷盗Tribolium castaneum（MK000439），中华豆芫菁Epicauta chinensis（KR181952），准噶尔小胸鳖甲Microdera dzhungaricapunctipennis（JF421286），三开蜣螂Copris tripartitus（EF208962），松墨天牛Monochamus alternatus（AF288978），马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata（AF288978，AF322911，KC544268，KC544269，KC544270）；双翅目Diptera：埃及伊蚊Aedes aegypti（ACJ64193），尖音库蚊Culex pipiens（AAX84696），果蝇Drosophila melanogaster（AAG26887），苹果实蝇Rhagoletis pomonella（ABL06948），南美斑潜蝇Liriomyza huidobrensis（AAW32098）；膜翅目Hymenoptera：金小蜂Nasonia vitripennis（XP_001606463），佛罗里达弓背蚁Camponotus floridanus（EFN61604），叶切蚁Acromyrmex echinatior（EGI70210）

2.4 温度胁迫下Ld-hsp70的表达

不同的温度和时间处理均能诱导马铃薯甲虫雌、雄成虫一定程度的表达。不同温度胁迫1 h后，马铃薯甲虫雌、雄成虫体内3个的相对表达量虽有一定程度的升高或降低，但与对照组（25℃）相比均无显著差异；不同温度胁迫处理4 h后，雌、雄成虫的相对表达量均有提高，其的相对表达量与对照相比分别在低温-10℃和高温44℃时显著上调至2.24和2.41倍（图5-A、5-B）。

和在高低温胁迫处理4 h后，相对表达量与对照相比均无显著差异（图5-C—F）；另外，无论是雌虫还是雄虫，3个的相对表达量在同一温度不同的胁迫处理时间下均无显著差异。

图中数据为平均值±标准误；柱上不同大、小写字母分别表示处理1 h和4 h时不同温度处理间差异显著（P＜0.05）（LSD法）Data in the figure are mean±SEand different letters above the bars indicate significant difference among different treatment temperatures for 1 h and 4 h, respectively (P＜0.05) (LSD method)

3 讨论

3.1 Ld-hsp70序列分析

本研究成功克隆了3个马铃薯甲虫的全长序列，并且它们编码的氨基酸序列均包含了完整保守结构域和3段保守的HSP70家族的典型基序，表明这3个属于典型的HSP家族。这些基因在氨基酸C末端均具有保守的亚细胞定位基序，的C末端具有内质网保守基序KDEL，和的C末端具有细胞质保守基序EEVD，表明Ld-hsp70b蛋白存在于内质网中，而Ld-hsp70a和Ld-hsp70c蛋白存在于细胞质中[31-32]，这种相似的保守基序也存在于HSP90家族中（细胞质定位基序MEEVD；内质网定位基序KDEL或HDEL）[33]。马铃薯甲虫HSP70家族的3个成员位于不同的细胞器中，在其他昆虫中也有相同的发现，如珍珠边豹纹蝶（）有7个HSP70基因，1个位于内质网，6个位于细胞质[34]；褐飞虱HSP70的15个家族成员，2个位于内质网，3个位于线粒体，其余位于细胞质或细胞核[28]。

序列比对发现，与的氨基酸序列相似性为71.85%，而与、的序列相似性分别只有59.26%和56.50%，表明在相同物种中，同一细胞区室内的HSP70之间相似度更高。根据HSP70在靠近C端是否具有简并重复的四肽序列GGXP，可将HSP70分为诱导型和组成型[35-36]。本研究中的编码蛋白有两个短肽GGXP序列出现在C端，可以推断属于诱导型HSP70，该类型只有受到外界因素诱导后才会大量增加，且这些重复序列可提供带负电且柔和的疏水性界面，促进蛋白合成中间体的排列折叠[37]；而其他两个在C端无GGXP序列，属于组成型HSP70，一般在无外界诱导时便有一定量的表达[38]。

系统进化树分析显示，3个分别聚类到3个分支上，表明其可能在马铃薯甲虫抵御不良的环境胁迫中发挥的作用不同。研究表明，HSP70基因可以作为系统进化研究的标志基因[39]。在马铃薯甲虫的HSP70系统进化树中，不同昆虫HSP70按照不同目单独聚类，亲缘关系较近的昆虫在系统进化树上HSP70位置较近，该结果与烟蚜（）[40]、三叶斑潜蝇[27]等昆虫的HSP70聚类结果一致。这一研究结果也与马铃薯甲虫HSP90进化分析结果一致，均可作为生物系统进化分析的候选基因[29]。

马铃薯甲虫HSP70蛋白的三维结构分析表明，3个HSP70蛋白N端均包含ATPase功能域，对ATP具有极高的亲和能力，ATPase功能域参与热激蛋白构象的转换、形成HSP70的分子伴侣复合物，并且在底物蛋白折叠的过程中至关重要[18,41]。马铃薯甲虫HSP70蛋白的C端是多肽结合区，研究发现其可以通过蛋白结构上的一段铰链区连接到N端核酸部位，引导多肽的折叠，起到分子伴侣作用[42]。与马铃薯甲虫热激蛋白60、90相比，这3类蛋白在结构上存在较大差异，如HSP90具有3个结构域：LM结构域（large middle domain）、SM结构域（small middle domain）和C结构域（C-terminal domain），LM结构域包含与分子伴侣、ATP和有害化学物质结合的位点，SM结构域主要参与分子伴侣和下游蛋白结合，C结构域参与二聚化，且含有与有害化学物质结合的位点[29]；HSP60也具有3个结构域：顶端域、赤道域和中间域，顶端域是底物结合部位，赤道域是ATP结合部位，中间域连接顶端域和赤道域[30]。这些高度保守的三维结构与其功能密不可分，表明马铃薯甲虫的这3类热激蛋白在其应激刺激中可能发挥不同的作用。

3.2 Ld-hsp70在温度胁迫下的功能分析

HSP70是与生物体温度耐受性关系最为密切的一类蛋白质，许多报道已证实高温和低温均能诱导生物体内的表达[22-23,26-27,43]。本研究同样发现马铃薯甲虫的3个在不同温度和时间胁迫下均能诱导表达，但是3个具有不同的诱导表达特异性，这一结果与三叶斑潜蝇的3个表达结果相似[26]。在马铃薯甲虫雌、雄成虫中的最佳诱导温度不同。在雌虫中，低温-10℃胁迫处理4 h后，的相对表达量升至对照的2.24倍，表明在低温胁迫后马铃薯甲虫通过提高体内的表达量，来帮助新生肽链的正确折叠，提高马铃薯甲虫对低温胁迫的适应力。而雄虫在高温44℃胁迫处理4 h后相对表达量显著上升，说明雌、雄两性成虫可能对温度的敏感性存在差异。此种现象在其他昆虫中也有类似发现，如Chen等[22]发现梨小食心虫在极端温度胁迫下雌虫HSP70基因的表达相比雄虫更敏感。杨苑钊[44]发现西藏飞蝗（）雄虫应对环境胁迫时HSP70基因诱导表达更为敏感。的相对表达量随着温度升高和胁迫时间的延长而增加，表明该基因属于诱导型蛋白，序列分析结果也证实了这一点。因此，笔者推测在马铃薯甲虫热耐受性过程中具有重要作用。

本研究发现和在不同温度和不同时间胁迫下相对表达量与对照相比无显著差异，推测这两个的作用并不能提高马铃薯甲虫的温度胁迫耐受性，而是受温度以外的其他因子调控。有研究发现，HSP70蛋白在机体细胞内的合成有一定的阈值，一旦超过这个阈值，HSP70蛋白的合成将出现下降[45-46]。因此，和的相对表达量出现下降现象，也可能是长时间温度胁迫损伤了马铃薯甲虫的部分机体，造成的损伤超出了对机体的保护能力，从而导致马铃薯甲虫热激蛋白表达途径的关闭。在三叶斑潜蝇[45]、美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇[21]、褐飞虱[46]等昆虫中均有类似的报道。另外，本研究还发现马铃薯甲虫成虫体内的3个相对表达量在同一温度、不同胁迫处理时间下均无显著差异，表明在本试验设定的同一温度下的相对表达量与处理时间之前没有显现出相关性。

同一物种不同组织间HSP70的同源性低于不同物种相同组织[28]。位于内质网和线粒体的HSP70与一般HSP70的亲缘关系较远，遗传距离大于不同物种间相同组织来源的HSP70。且位于不同组织的HSP70在减少昆虫所受胁迫伤害中具有一定的协同作用，如位于内质网和细胞质的HSP70可通过协同作用提高昆虫机体对高温的适应性[47]。本研究对3个的氨基酸序列分析表明，Ld-hsp70b属于内质网型热激蛋白，Ld-hsp70a和Ld-hsp70c属于胞质型热激蛋白，表达量变化相对显著，而和却与对照相比无显著差异，3个的表达情况也进一步验证了这一观点。在应对温度胁迫时，马铃薯甲虫体内并非某一热激蛋白起作用，而是由不同热激蛋白共同协作抵抗逆境胁迫。而马铃薯甲虫体内这些不同是如何协作来抵御环境胁迫还需要进一步探讨。

4 结论

马铃薯甲虫在雌虫遭受低温胁迫时显著升高，在雄虫遭受高温胁迫时显著升高，其对高、低温均敏感，可能在马铃薯甲虫抵御极端温度胁迫中发挥作用。而和对高、低温均不敏感。推测马铃薯甲虫同一家族的3个在相同刺激下可能具有不同功能。

[1] CLEMENTS J, SCHOVILLE S, CLEMENTS A, AMENZIAN D, DAVIS T, SANCHEZ-SEDILLO B, BRADFIELD C, HUSETH A S, GROVES R L. Agricultural fungicides inadvertently influence the fitness of Colorado potato beetles,, and their susceptibility to insecticides. Science Reports, 2018, 8(1): 13282.

[2] IZZO V M, CHEN Y H, SCHOVILLE S D, WANG C, HAWTHORNE D J. Origin of pest lineages of the colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae).Journal of Economic Entomology, 2018, 111(2): 868-878.

[3] 高玉林, 徐进, 刘宁, 周倩, 丁新华, 詹家绥, 成新跃, 黄剑, 鲁宇文, 杨宇红. 我国马铃薯病虫害发生现状与防控策略. 植物保护, 2019, 45(5): 106-111.

GAO Y L, XU J, LIU N, ZHOU Q, DING X H, ZHAN J S, CHENG X Y, HUANG J, LU Y W, YANG Y H. Current status and management strategies for potato insect pests and diseases in China. Plant Protection, 2019, 45(5): 106-111. (in Chinese)

[4] 徐进, 朱杰华, 杨艳丽, 汤浩, 吕和平, 樊明寿, 石瑛, 董道峰, 王贵江, 王万兴, 熊兴耀, 高玉林. 中国马铃薯病虫害发生情况与农药使用现状. 中国农业科学, 2019, 52(16): 2800-2808.

XU J, ZHU J H, YANG Y L, TANG H, LÜ H P, FAN M S, SHI Y, DONG D F, WANG G J, WANG W X, XIONG X Y, GAO Y L. Status of major diseases and insect pests of potato and pesticide usage in China. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(16): 2800-2808. (in Chinese)

[5] BOITEAU G. Recruitment by flight and walking in a one-generation Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) environment. Environmental Entomology, 2001, 30(2): 306-317.

[6] WEBER D. Colorado beetle: pest on the move.Pesticide Outlook, 2003, 14(6): 256-259.

[7] LI C, LIU H, HUANG F N, CHENG D F, WANG J J, ZHANG Y H, SUN J R, GUO W C. Effect of temperature on the occurrence and distribution of colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) in China. Environmental Entomology, 2014, 43(2): 511-519.

[8] STRATAMAN K N, OVERHOLT W A, CUDA J P, MUKHERJEE A, DIAZ R, NETHERLAND M D, WILSON P C. Temperature- dependent development, cold tolerance, and potential distribution of(Diptera: Chironomidae), a tip miner of(Hydrocharitaceae). Journal of Insect Science, 2014, 14: 153.

[9] 洪波, 程登发, 吐尔逊, 郭文超, 陈林, 张云慧. 新疆地区马铃薯甲虫发育与温度关系的研究. 植物保护, 2009, 35(6): 60-63.

HONG B, CHENG D F, TUESUN, GUO W C, CHEN L, ZHANG Y H. The relationships between temperature and development of the Colorado potato beetle in Xinjiang. Plant Protection, 2009, 35(6): 60-63. (in Chinese)

[10] 张云慧, 张智, 何江, 吐尔逊, 程登发. 马铃薯甲虫自然种群抗寒能力测定. 植物保护, 2012, 38(5): 64-67.

ZHANG Y H, ZHANG Z, HE J, TUESUN, CHENG D F. Cold hardiness of natural populations of the Colorado potato beetle,. Plant Protection, 2012, 38(5): 64-67. (in Chinese)

[11] 周昭旭, 罗进仓, 吕和平, 郭文超. 温度对马铃薯甲虫生长发育的影响. 昆虫学报, 2010, 53(8): 926-931.

ZHOU Z X, LUO J C, LÜ H P, GUO W C. Influence of temperature on development and reproduction of experimental populations of the Colorado potato beetle,(Say) (Coleoptera: Chrysomelidae). Acta Entomologica Sinica, 2010, 53(8): 926-931. (in Chinese)

[12] 李超, 程登发, 刘怀, 张云慧, 孙京瑞. 温度对马铃薯甲虫分布的影响——以新疆吐鲁番地区夏季高温对其羽化的影响为例. 中国农业科学, 2013, 46(4): 737-744.

LI C, CHENG D F, LIU H, ZHANG Y H, SUN J R. Effects of temperature on the distribution of the colorado potato beetle ()—effect of high temperature on its emergence in Turpan, Xinjiang. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(4): 737-744. (in Chinese)

[13] ZHAO L, JONES W A. Expression of heat shock protein genes in insect stress responses. Invertebrate Survival Journal, 2012, 9: 93-101.

[14] MORIMOTO R I. Cells in stress: transcriptional activation of heat shock genes.Science, 1993, 259(5100): 1409-1410.

[15] 闫硕, 熊晓菲, 褚艳娜, 李贞, 巫鹏翔, 杨清坡, 崔维娜, 徐金涛, 徐丽霞, 张青文, 刘小侠. 异色瓢虫胁迫对棉铃虫生长发育及压力蛋白基因表达的影响. 中国农业科学, 2017, 50(21): 4118-4128.

YAN S, XIONG X F, CHU Y N, LI Z, WU P X, YANG Q P, CUI W N, XU J T, XU L X, ZHANG Q W, LIU X X. Effects of predator-induced stress fromon the development and stress protein gene expression of. Scientia Agricultura Sinica,2017,50(21): 4118-4128. (in Chinese)

[16] VELAZQUEZ J M, LINDQUIST S. HSP70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell, 1984, 36(3): 655-662.

[17] KIANG J G, TSOKOS G C. Heat shock protein 70 kDa: molecular biology, biochemistry, and physiology. Pharmacology and Therapeutics, 1998, 80(2): 183-201.

[18] MAYER M P, BUKAU B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences, 2005, 62(6): 670-684.

[19] DAUGARRD M, ROBDE M, JAATTELA M. The heat shock protein 70 family: highly homologous proteins with overlapping and distinct functions. FEBS Letter, 2007, 581(19): 3702-3710.

[20] YANG L H, JIANG H B, LIU Y H, DOU W, WANG J J. Molecular characterization of three heat shock protein 70 genes and their expression profiles under thermal stress in the citrus red mite. Molecular Biology Reports,2012, 39(4): 3585-3596.

[21] HUANG L H, KANG L. Cloning and interspecific altered expression of heat shock protein genes in two leafminer species in response to thermal stress. Insect Molecular Biology, 2007, 16(4): 491-500.

[22] CHEN H, XU X L, LI Y P, WU J X. Characterization of heat shock protein 90, 70 and their transcription expression patterns on high temperature in adult of(Busck). Insect Science, 2014, 21(4): 439-448.

[23] JIN J, ZHAO M, WANG Y, ZHOU Z, WAN F, GUO J. Induced thermotolerance and expression of three key Hsp genes (,, and) and their roles in the high temperature tolerance of. Frontiers in Physiology, 2020, 10: 1593.

[24] MAHROOF R, ZHU K Y, NEVEN L, SUBRAMANYAM B, BAI J F. Expression patterns of three heat shock protein 70 genes among developmental stages of the red flour beetle,(Coleoptera: Tenebrionidae). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular and Integrative Physiology, 2005, 141(2): 247-256.

[25] UDAKA H, UEDA C, GOTO S G. Survival rate and expression of heat-shock protein 70 and frost genes after temperature stress inlines that are selected for recovery time from temperature coma. Journal of Insect Physiology, 2010, 56(12): 1889-1894.

[26] LU K, CHEN X, LIU W T, ZHANG Z C, WANG Y, YOU K K, LI Y, zhang r b, zhou q. Characterization of heat shock protein 70 transcript from(Stål): its response to temperature and insecticide stresses. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2017, 142: 102-110.

[27] CHANG Y W, ZHANG X X, CHEN J Y, LU M X, GONG W R, DU Y Z. Characterization of three heat shock protein 70 genes fromand expression during thermal stress and insect development. Bulletin of Entomological Research, 2019, 109(2): 150-159.

[28] 单丹, 王利华, 张月亮, 韩阳春, 牛洪涛, 潘磊, 方继朝. 褐飞虱热激蛋白70在不同温度胁迫下的差异表达特性研究. 中国水稻科学, 2017, 31(5): 533-541.

SHAN D, WANG L H, ZHANG Y L, HAN Y C, NIU H T, PAN L, FANG J C. Induced expression profiles ofin brown planthoppers,, under different temperatures. Chinese Journal of Rice Science, 2017, 31(5): 533-541. (in Chinese)

[29] 蒋健, 李祥瑞, 张云慧, 郭文超, 程登发, 郭青云. 马铃薯甲虫热激蛋白基因的克隆及温度胁迫下的表达. 植物保护学报, 2013, 40(5): 399-406.

JIANG J, LI X R, ZHANG Y H, GUO W C, CHENG D F, GUO Q Y. cDNA cloning of heat shock protein 90 () in(Coleoptera: Chrysomelidae) and its expression under temperature stress. Journal of Plant Protection,2013, 40(5): 399-406. (in Chinese)

[30] 魏长平, 蒋健, 李祥瑞, 张云慧, 张方梅, 程登发, 郭文超, 刘怀. 马铃薯甲虫热激蛋白基因的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达. 昆虫学报, 2017, 60(5): 523-532.

WEI C P, JIANG J, LI X R, ZHANG Y H, ZHANG F M, CHENG D F, GUO W C, LIU H. Cloning and sequence analysis of heat shock protein gene(Coleoptera: Chrysomelidae) and its expression under temperature stress. Acta Entomologica Sinica, 2017, 60(5): 523-532. (in Chinese)

[31] GUPTA R S, AITKEN K, FALAH M, SINGH B. Cloning ofheat shock protein HSP70 homologs: implications regarding origin of eukaryotic cells and of endoplasmic reticulum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91(8): 2895-2899.

[32] BOORSTEIN W R, ZIEGELHOFFER T, CRAIG E A. Molecular evolution of the HSP70 multigene family. Journal of Molecular Evolution, 1994, 38(1): 1-17.

[33] GUPTA R S. Phylogenetic analysis of the 90 kD heat shock family of protein sequences and an examination of the relationship among animals, plants, and fungi species. Molecular Biology and Evolution, 1995, 12(6): 1063-1073.

[34] LUO S, AHOLA V, SHU C, XU C, WANG R. Heat shock protein 70 gene family in the Glanville fritillary butterfly and their response to thermal stress. Gene, 2015, 556(2): 132-141.

[35] SCHMID D, BAICI A, GEHRING H, CGRISTEN P. Kinetics of molecular chaperone action. Science, 1994, 263(5149): 971-973.

[36] WU S J, LIU F H, HU S M, WANG C. Different combinations of the heat-shock cognate protein 70 (hsc70) C-terminal functional groups are utilized to interact with distinct tetratricopeptide repeat-containing proteins. Biochemical Journal, 2001, 359(2): 419-426.

[37] TANG Y C, CHANG H C, ROEBEN A, WISCHNEWSKI D, WISCHNEWSKI N, KEMER M J, HARTL F U, HAVER-HARTL M. Structural features of the GroEL-GroES nano-cage required for rapid folding of encapsulated protein. Cell, 2006, 125(5): 903-914.

[38] LINDQUIST S. The heat shock response. Annual Review of Biochemistry, 1986, 55: 1151-1191.

[39] LU M X, LI H B, ZHENG Y T, SHI L, DU Y Z. Identification, genomic organization and expression profiles of four heat shock protein genes in the western flower thrips,. Journal of Thermal Biology, 2016, 57: 110-118.

[40] 杨昌利, 孟建玉, 苏丽, 张长禹. 烟蚜热激蛋白基因MpHsp70的克隆及在UV-B胁迫下的表达分析. 昆虫学报, 2019, 62(1): 133-140.

YANG C L, MENG J Y, SU L, ZHANG C Y. Cloning of heat shock protein gene MpHsp70 and its expression analysis under UV-B stress in(Hemiptera: Aphididae). Acta Entomologica Sinica, 2019, 62(1): 133-140. (in Chinese)

[41] BUKAU B, WEISSMAN J, HORWICH A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell, 2006, 125(3): 443-451.

[42] ZHU X, ZHAO X, BURKHOLDER W F, GRAGEROV A, OGATA C M, GOTTESMAN M E, HENDRICKSON W A. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science, 1996, 272(5268): 1606-1614.

[43] LYYTINEN A, MAPPES J, LINDSTROM L. Variation in Hsp70 levels after cold shock: signs of evolutionary responses to thermal selection amongpopulations. PLoS ONE, 2012, 7(2): e31446.

[44] 杨苑钊. 西藏飞蝗热激蛋白70基因的片段克隆、序列分析及表达分析[D]. 成都: 四川农业大学, 2016.

YANG Y Z. Cloning and sequence analysis and expression analysis of fragment of heat shock protein 70 gene ofChen[D]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[45] 郑丹, 崔旭红, 李红亮, 蔡冲, 高永生, 商晗武. 三叶草斑潜蝇的克隆及其表达量在高低温胁迫下的变化. 植物保护学报, 2010, 37(2): 159-164.

ZHENG D, CUI X H, LI H L, CAI C, GAO Y S, SHANG H W. Cloning of heat shock protein gene,, inand its expression under temperature stress. Journal of Plant Protection, 2010,37(2): 159-164. (in Chinese)

[46] 季璐, 崔旭红, 朱敏. 短时高温胁迫对褐飞虱存活及其热激蛋白基因表达的影响. 植物保护学报, 2015, 42(4): 619-625.

JI L, CUI X H, ZHU M. Effects of brief heat shock on the survival andexpression of brown planthopper(Stal).Journal of Plant Protection,2015, 42(4): 619-625. (in Chinese)

[47] XU X, GUPTA S, HU W L, MCGRATH B C, CAVENER D R. Hyperthermia induces the ER stress pathway. PloS ONE, 2011, 6(8): e23740.

Cloning of Heat Shock Protein Geneand its Expression Characteristics under Temperature Stress

ZHENG HaiXia1, GAO YuLin2, ZHANG FangMei2,3, YANG ChaoXia1,2, JIANG Jian2, ZHU Xun2, ZHANG YunHui2, LI XiangRui2

1College of Plant Protection, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;3College of Agronomy, Xinyang Agriculture and Forestry University, Xinyang 464000, Henan

【】Heat shock protein (HSP), a class of highly conserved proteins, is generally found in all the organisms, which plays an important role in response to stress resistance. In order to ensure the normal physiological activities of the organism, the expression of HSP can be generated rapidly under the adverse environmental conditions. The objective of this study is to clone heat shock protein 70 (HSP70) genes of the important quarantine pest(), analyze their expression characteristics under temperature stress, and to clarify the function ofHSP70 under temperature stress.【】The cDNA sequences of HSP70 genes ofwere obtained based on the NCBI database. The full length cDNAs encoding HSP70 genes ofwere cloned by RT-PCR and RACE technology. The full-length sequences were spliced by DNAMAN software. The sequence characteristics ofwere analyzed by bioinformatic methods. The phylogenetic tree with the homologous sequences of HSP70 fromand other insects was constructed using the neighbor-joining (NJ) method with MEGAX software. The expression profiles ofwere analyzed by qRT-PCR.the specific primers were designed using Primer 5.0 software.【】The cDNA sequences of three HSP70 genes ofwere obtained from the NCBI database, and were named as HSP70a, HSP70b and HSP70c, respectively. Three full-length sequences were obtained by cloning and splicing, and were named as,and, respectively. The GenBank accession numbers were KC544268, KC544269 and KC544270, respectively. Sequence analysis showed that complete conserved domain, three signature sequences of HSP70 family, signal sequences and motifs of subcellular location at the carboxyl (C)-terminal were found in amino acid sequences of the three. The conserved EEVD motif in the C-terminal ofandindicated that they were cytosolic HSP70. The conserved KDEL motif in the C-terminal ofindicated that it was endoplasmic reticulum HSP70. Phylogenetic tree analysis showedandwere clustered together with HSP70 from other insect species, whilewas clustered together with the reported HSP70 from.,andhad highest homology with,, and, respectively. qRT-PCR results showed that the expression of all threecould be induced by high and low temperatures. No significant difference was observed in the relative expression of the threes after exposure to different temperatures for 1 h. the relative expression level ofwas significantly upregulated by 2.24 and 2.41 folds after exposure to -10℃ and 44℃ for 4 h in female and male of, respectively. However, no significant difference was observed in the relative expression ofandunder temperature treatments for 4 h. Whetherin female or male, no significant difference was observed of different treatment times at the same temperature.【】incan respond to temperature stress and may play an important role in the adaptation to adverse temperatures.andare not very sensitive to temperature stress, suggesting functional differentiation of the threein response to abiotic stress.

; temperature stress; heat shock protein 70; expression profile