国产化细胞扩增系统及其配套工艺技术分析

程锦生

（上海东富龙医疗装备有限公司，上海 201108）

关键字：细胞扩增系统；一次性生物反应器；生物制药；自动化；一次性技术

一次性使用技术（Single-use Technologies），同时也称作一次性使用系统（Single Use Systems，SUS）或一次性使用设备（Single Use Equipment），是一种工艺设备解决方案，其种类繁多，应用范围广[1]。在生物制药领域，近年来，随着该技术的不断发展，已广泛应用于生物制药领域，并开始改变该领域的生产方式。

生物工艺中一次性使用系统，同时也称作药用一次性使用技术，是一种工艺耗材解决方案，通常由聚合材料组件装配而成，形成一个系统或单元操作，用于单次或一个阶段性生物工艺或制药生产活动[2]。其具备固定投入小、节省时间、污染风险低、操作灵活等优势，可以加快药物的研发及上市速度[3]。随着生物制品行业的快速发展，一次性使用技术正在逐步完善，并广泛应用于生物制药各个生产环节，特别是蛋白、抗体、疫苗及细胞治疗产品的生产制备[4]。生物工艺中常见的一次性使用系统主要有一次性混合系统、一次性生物反应器、一次性纯化系统及一次性灌装系统等。

总体来说，我国一次性技术的应用起步较晚，发展迅速，越来越多的制药企业将一次性技术引入到制药工艺中，但绝大多数一次性设备系统均为国外品牌，国内一次性技术设备研发生产技术能力薄弱，市场被国外品牌垄断，严重制约我国生物技术的发展。细胞培养/发酵用一次性生物反应器作为生物技术的核心，一直是一次性技术研究的焦点，自1996年一次性生物反应器问世以来，经过20 多年的发展，一次性生物反应器技术逐渐成熟，可以满足多种不同类型及规模的生产要求[5-6]。但是，纵观国内市场，一次性生物反应器还是以国外品牌为主，如Thermo、Sartorius 以及GE 等，缺乏具备竞争力的国产化自主品牌。为了打破国外的垄断，经过长期的研究，开发了国产化一次性生物反应器系统，该系统及配套耗材均由自主研发生产，并配套对应生产工艺技术，可实现国外品牌的完全替代。

1 一次性细胞扩增系统

一次性细胞扩增系统（CES）是自主研发的国产化摇摆式一次性生物反应器，可应用于蛋白、抗体、疫苗及细胞治疗产品的种子细胞扩增及生产。根据不同的配置需求，可适用于不同的培养模式，系统设备规格齐全，覆盖0.1～100 L 培养体积需求，可实现连续逐级放大培养及不同规模的生产要求。系统配备一次性培养袋（CES-BAG）使用，形成全密闭的一次性体系，袋内5 倍以上的培养体积放大，可有效地简化生产操作并预防污染，一次性培养袋使用后无害化处理，大大简化后续清洁作业并有效杜绝潜在的污染风险。

一次性细胞扩增系统主要分为自动化控制单元及摇摆器。自动化控制单元包含：主机电脑系统，蠕动泵，气体供应及压力检测模块，如图1所示。

图1 自动化控制单元Fig.1 Automation control unit

摇摆器包含：摇摆运动单元、加热单元、pH 值/DO 检测单元、温度监测单元、过滤器单元保温箱体、称重装置。摇摆运动单元由摆动电机带动托盘轴承导向进行往复圆周摆动；加热单元由加热元件和导热底板组成，采用接触加热的方式进行加热；pH 值/DO 监测单元由pH 值和DO 变送器及光纤组成，通过光纤连接变送器及一次性培养袋检测，进行精准测量及控制。温度监测单元主要由温度传感器接收温度信息用于监测及控制温度；过滤器单元由过滤器加热器及支架组成，通过加热器的温控加热实现对尾气过滤器加热；保温箱体由RIM 反应注射聚氨酯工艺制成，提供优良保温隔热性能；称重装置包含高度调节元件，缓冲元件，称重元件，有效地解决了细胞扩增摇床工作过程中摆动引起的重量偏差，能够不受细胞扩增摇床摆动干扰，精确测量细胞扩增摇床加液量。

图2 摇摆器Fig.2 Rocker unit

以上单元模块通过组合并结合自动化控制系统软件组成一次性细胞扩增系统设备，系统通过与一次性培养袋配合使用，组成密闭的一次性细胞培养/发酵工艺平台，为蛋白、抗体、疫苗及细胞治疗产品的种子细胞扩增及生产提供良好的国产化一次性工艺方 案。

2 一次性细胞扩增系统配套应用工艺

细胞培养/发酵工艺是生物制药的关键核心，不同的设备对应不同的工艺技术路线，一套成熟的工艺需要经过一系列的开发及优化过程，可能需要相当长的时间。为了更好地支持生物制药工艺技术与细胞扩增系统的结合，提供配套的工艺作为基础技术路线以供参考是非常必要的。针对不同的细胞类型及培养方式，在验证实验室条件下开发获得了对应的工艺参数，本文以HEK 293 无血清悬浮培养为例，进行应用工艺及效果介绍。

2.1 HEK 293 悬浮培养参考参数

对于不同培养体系下最佳参数值，应在使用时调整，需要调整的情况及调整方法主要有：

（1）溶氧水平低：调高转速及摆动角度，角度调整优先；

（2）细胞聚集成团：调高转速及摆动角度，角度调整优先；

（3）产生大量气泡：降低转速，提高摇摆角度。

2.2 HEK 293 逐级放大培养作业工艺流程

2.2.1 HEK 293 细胞株复苏及上游细胞摇瓶培养，当细胞量达到CES 细胞扩增系统所需接种量时，即可接种至CES 细胞扩增系统进行逐级放大培养。

注：接种一般建议细胞密度不小于0.6×106/mL，最小接种体积为CES-BAG 最大体积的10%。

2.2.2 选择适当规格的CES 细胞扩增系统及配套CES-BAG，参考CES 使用说明连接设备管线并安装CES-BAG。

2.2.3 CES 细胞扩增系统开机，登录系统控制软件，设定作业批号，选择培养模式并充气，之后进入“校正”界面，进行泵校正及pH 值/DO（输入CESBAG 参数）确认。

注：系统软件根据关联设定自动监控pH 值和DO，pH 调节可关联CO2或酸/碱，DO 可关联O2和N2。

2.2.4 使用补料瓶或补料袋通过内置/外置泵将预先配制的新鲜培养基泵入CES-BAG 内，设定培养基平衡过程中的运行参数，培养基介质平衡需2 h 以上。

注：介质平衡过程中pH 值与温度参数设定要求与培养过程基本相同，pH 值设定7.0/7.1，温度设定在36.5～37℃之间，摇摆速度、角度及通气量参考《工艺参数设置参考明细表》中参数。

2.2.5 当介质培养基pH 值及温度完全平衡后，取样4～8 mL 检测pH 值，根据检测值进入“校正”界面设置偏离值并标定100% a.s DO。

2.2.6 收集上游HEK 293 细胞至转种瓶，通过设定的补料泵接种至CES-BAG 内的已平衡培养基中，设定培养T：36.5～37℃，pH 值：7.0/7.1，DO：40%，并设定对应的死区及报警上限，摇摆速度、摇晃角度及通气量，参考表1。

表1 工艺参数设置参考表（数据来自验证实验室）Tab.1 Process parameters settings reference list

注：推荐设定值，死区：T 为0.2℃，pH 值为0.2，DO 为2%；报警上下限T 为35.5～37.5℃，pH 值为6.7/7.4，DO 为38%～150%。

2.2.7 点击“启动”按钮开始设备运行，CES 细胞扩增系统根据设定参数及关联设定自动通过PID 控制，细胞培养过程中取样监测细胞密度、活率、糖含量及代谢情况，根据需要添加培养基或补料继续培养。在培养过程中随着细胞密度扩大及培养体积扩大，转速、摇晃角度及通气量需做适当调节，详参见表1。

2.2.8 当CES-BAG 内细胞培养体积放大到最大，可继续培养，在细胞处于指数生长期时，收获转种至下一级CES细胞扩增系统或大规模生物反应器继续培养。

2.3 应用实例

CES-100L HEK 293 无血清培养。

2.3.1 培养流程

（1）将培养的种子细胞接种至CES-100L 的100 L CES-BAG（有效培养体积10～50 L）内，初始接种体积10 L，初始接种密度0.6×106/mL。

（2）设定初始培养参数（pH 值/DO 模式）T：37℃、pH 值：7.0、DO：40%、转速：12 r/min、角度：5°，通气量1 000 mL/min。

（3）培养过程中，CES-100S 细胞扩增系统自动监控培养过程关键参数，作业人员每天通过取样程序，使用注射器从取样口取样检测，检测活细胞密度、活性、pH 值、Gluc 并记录。

（4）根据细胞检测结果按照0.6×106/mL 补充培养基，扩大培养。

（5）当培养体积扩大到最大培养体积50 L 时，继续培养，补充葡萄糖，维持糖含量2～6 g/L。

注：测试过程关键参数设定详见表2。

表2 细胞培养参数记录表Tab.2 Cell expension main parameters daily test record

图3 CES-100L HEK 293 生长曲线Fig.3 CES-100L HEK 293 cell expension profile

2.3.2 细胞培养效果

结果评价：HEK293 细胞在接种后即开始进入快速增长，HEK293 最高活细胞密度（PVCD）1.234×107/ mL，到达平台最高密度之前，细胞活性保持在95%以上。细胞培养扩增效果满足用户需求，完全可以替代进口设备。

一次性细胞扩增系统系列产品型号有10 L、25 L、50 L、100 L 及200 L，细胞培养体积0.2～100 L，对市面上同类进口设备的培养体积规模实现全覆盖，满足上游细胞、规模化放大及生产表达要求，可有力支持我国抗体、蛋白、疫苗及细胞基因行业的研发及规模化生产。

3 结束语

一次性细胞扩增系统是自主国产化一次性生物反应器设备系统，为细胞培养/发酵提供一次性工艺解决方案支持，可实现对进口品牌的国产化替代，有助于打破进口品牌对国内市场的垄断。目前一次性扩增系统已经成功应用于多种生物制药技术领域，尤其在疫苗及免疫细胞治疗领域，未来随着其在生物制药领域应用的深入，一次性扩增系统设备及配套技术将逐步优化提升，得到更广泛的认可，实现对进口品牌的完全替代。