胶质瘤干细胞外泌体通过PI3K/Akt信号通路促进胶质瘤U87细胞侵袭、迁移

任光辉 李武雄 齐利豪

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，病死率、致残率高[1，2]。外泌体（exosomes，exo）是细胞在生理、病理条件下释放到胞外的一种双层膜囊泡，能与靶细胞受体结合或水平转移内含物而发挥生物学功能[3]。研究发现，肿瘤细胞来源的exo 能通过不同机制影响肿瘤的侵袭、转移、血管生成等[4]。本研究探讨胶质瘤干细胞外泌体（glioma stem cells exosomes，GSCs-exo）对体外培养的胶质瘤U87细胞侵袭、迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养U87 胶质瘤细胞株（中国医学科学院基础医学研究所基础学细胞中心提供）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养。

1.2 GSCs 分离、培养及鉴定 取对数生长期U87 细胞，消化重悬后，转移至干细胞培养液（上海索莱宝科技有限公司）培养至第3代细胞，转移至防脱载玻片，贴壁后以多聚甲醛固定，清洗后依次加入Nestin抗体、CD133 一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜，清洗后加入FITC标记的二抗（1∶400；德国默克公司），室温下孵育1 h，避光处理，加入核衬染物DAPI，室温孵育10 min，荧光显微镜下观察。同时在有多聚左旋赖氨酸涂层的载波片上进行第3代GSCs 诱导分化，常规培养5 d后，进行GFAP荧光染色，2周后进行Neun染色，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.3 GSCs-exo 的提取与鉴定 超速离心法提取exo。按照QIAAGEN GSCs-exo 提取试剂盒（上海李记生物科技有限公司）说明书，收集GSCs 上清细胞培养液，加入XWP、XE 缓冲液分别离心洗涤、洗脱，获得GSCs-exo 混合液固定，加入3%磷钨酸溶液负染，透射显微镜下观察GSCs-exo形态。RIPA裂解液（上海索莱宝科技有限公司）提取GSCs-exo 蛋白，10%SDS-PAGE电泳分离转移至PVDF膜，室温封闭2 h，加入CD63 一抗（1:500），4 ℃孵育过夜，加入HRP 标记的二抗（1:5 000），孵育2 h，ECL曝光拍照。

1.4 干预与分组 取50 μl GSCs-exo，经RIPA裂解液处理，BCA 试剂盒（上海纪宁生物科研试剂盒公司）测量蛋白浓度，以10% exo 血清培养液分别稀释至20、40、80 μg/ml。取对数生长期U87 细胞接种于6孔板中，密度调整为1×105/孔，随机分为4组：对照组和高、中、低GSCs-exo 浓度组（分别加入20、40、80 μg/ml的GSCs-exo），每组5个复孔。

1.5 Transwell 实验检测U87 细胞侵袭能力100 μl 50 mg/L的Matrigel基质胶1∶40稀释液包被底部膜上室面。收集对数生长期细胞，按照2×105个/孔移入Transwell 小室，下层加入10%胎牛血清的1640 培养基500 μl，对照组、GSCs-exo组小室上室分别加入无血清1640 培养基150 μl 和重悬外泌体150 μl，37 ℃培养24 h，甲醇室温固定10 min。侵袭置滤膜下表面的细胞以结晶紫染色，正置显微镜下随机选取5个视野拍照，计算穿膜细胞数，取平均值。

1.6 划痕实验检测U87 细胞迁移能力 对数生长期细胞以2×105个/孔接种于6孔板常规培养，细胞贴壁生长时，弃培养基，以50 μl 无菌移液枪头在培养板中间划线，后加入完全培养基继续培养24 h后拍照，计算细胞迁移率。迁移率（%）=（初始划痕宽度-24 h后划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.7 免疫印记法检测U87 细胞磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，Akt）、L1CAM 收集各组细胞，RIPA 裂解液处理，BCA 定量蛋白，SDS-PAGE 法分离，转移至PVDF 膜，封闭液封闭，加入一抗（1:2 000），4 ℃封闭过夜，加入二抗（1:10 000；厦门慧嘉生物科技有限公司），室温孵育2 h，ECL 显影，分析目的条带灰度值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 25.0进行处理；定量资料以±s表示，采用单因素方差分析和t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSCs 的鉴定结果 肿瘤细胞球由多个细胞组合而成，即GSCs（图1）。荧光染色可见CD133（图2a）与Nestin（图2b）呈阳性表达。诱导分化5 d 后GSCs分化成胶质细胞，GFAP 阳性表达（图2c），2 周后GSCs分化为神经元细胞，Neun阳性表达（图2d）。

2.2 GSCs-exo 鉴定结果GSCs-exo 为圆形或椭圆形囊泡结构，直径30～100 nm，双层膜包被（图3a）。提取的GSCs-exo 总蛋白显示表达相关标志蛋白CD63（图3b）。

2.3 GSCs-exo 对U87 细胞侵袭能力的影响 高浓度GSCs-exo 组侵袭细胞数量[（135.32±13.47）个]明显高于中浓度GSCs-exo 组[（108.36±11.35）个；P＜0.05]，而中浓度GSCs-exo 组明显高于低浓度GSCsexo 组[（88.45±8.23）个；P＜0.05]，低浓度GSCs-exo 组明显高于对照组[（65.32±6.35）个；P＜0.05]。

2.4 GSCs-exo 对U87 细胞迁移能力的影响 高浓度GSCs-exo组细胞迁移率[（88.36±8.35）%]明显高于中浓度GSCs-exo组[（72.39±7.25）%；P＜0.05]，而中浓度GSCs-exo 组明显高于低浓度GSCs-exo 组[（46.35±6.89）%；P＜0.05]，低浓度GSCs-exo 组明显高于对照组[（23.56±5.12）%；P＜0.05]。

图1 胶质瘤干细胞形态鉴定（×40

图2 胶质瘤干CD133、Nestin、GFAP、Neun免疫荧光染色鉴定（×40）

图3 胶质瘤干细胞外泌体鉴定

图4 免疫印迹法检测GSCs-exo 对U87 细胞L1CAM、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响

表1 GSCs-exo对U87细胞L1CAM、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响

2.5 GSCs-exo 对U87细胞PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响 与对照组比较，GSCs-exo组L1CAM、PI3K蛋白表达量及p-AKt/Akt比值明显增高（P＜0.05），而且随GSCs-exo 浓度增加明显增高（P＜0.05）。见表1、图4。

3 讨论

本研究结果显示，GSCs-exo 能促进胶质瘤U87细胞的侵袭和迁移，而且，GCSs-exo组L1CAM、PI3K与p-AKt/Akt 水平均明显升高；均呈浓度依赖性。这说明GSCs-exo 可上调L1CAM、PI3K 表达，促进Akt磷酸化，从而促进U87细胞侵袭和迁移。

GSCs可自我更新、多向分化、无限增殖，对胶质瘤的生长、转移、浸润、复发及治疗敏感性有决定性作用[4，5]。exo 在细胞间的物质和信息传递中有重要的转导作用，参与肿瘤生长、转移。肿瘤细胞来源的exo，因携带miRNA、DNA 片段、蛋白质、脂质等多种功能分子，能为肿瘤的侵袭和转移提供条件[6]。邹敏等[7]研究显示，缺氧环境下肝癌细胞分泌的exo，可促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵。Gong 等[8]发现，GSCs-exo能促进血管内皮细胞的增殖和迁移。

L1CAM 是细胞黏附分子免疫球蛋白超家族的重要成员[9]。张媛[10]研究发现，L1CAM能直传递双向信号，影响细胞的结构、基因表达、细胞增殖和细胞分化等生物学行为，促进肿瘤细胞的侵袭与转移。另外，L1CAM 还可调控血管的生成，参与肿瘤的发展，并提高肿瘤细胞耐药性[11]。PI3K 是具有催化活性的胞内磷脂酰肌醇激酶，Akt 是PI3K 下游的靶向调节分子，Akt可在PI3K的磷化产物激活后发生质-膜转移而被激活，通过磷酸化作用影响胞浆内的生物学信号传递，调控细胞的增殖、侵袭、转移等过程[12，13]。

综上所述，GSCs-exo 可促进胶质瘤U87 细胞的侵袭与迁移，可能与上调L1CAM、PI3K 表达，促进Akt磷酸化有关。