LncRNA与成骨分化相关信号通路的研究进展

刘岩，赵志军，冯士军，韩彦军，张春阳

骨骼是形成人体支持框架、参与各种生理功能的高度功能化的结缔组织，如调节血液酸碱度、钙和磷酸盐水平等；颅骨是机体骨骼系统的重要组成部分之一。骨组织的细胞成分主要包括成骨细胞、破骨细胞和骨细胞[1]。成骨细胞和破骨细胞是骨代谢中成骨过程与破骨过程中的重要功能细胞，其中成骨细胞的作用是骨的形成，而破骨细胞的作用是骨的吸收，主要参与骨基质的合成、分泌、矿化的过程[2]。而成骨细胞分化是一个复杂的过程，受转录因子Runx2、p57和Sp7等的严格控制，调控着大量关键下游促成骨靶基因的转录[3]。近年来，研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)可通过复杂机制网络调控成骨标志物或关键调节因子及相关途径参与骨生成；其在体内的表达水平失调与骨质疏松密切相关。LncRNA在表观遗传水平、转录及转录后水平参与了调控基因的表达，调节细胞组织功能，促进细胞增殖，如成骨细胞的分化。在癌基因或抑制基因表达中，LncRNA也起着调节作用[4]，调控癌症(如乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肺癌等)发生发展的相关生物过程[5]，可作为诊断、治疗及判定预后的生物标志物。目前，对于LncRNA在成骨过程中发挥重要调控作用的研究日益增多；其中Wnt/β信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路、转化生长因子β/骨形态发生蛋白(TGF-β/BMP)、Notch及Hedgehog信号通路等备受关注。现对LncRNA及其通过调节相关信号通路进而调控成骨细胞形成和成骨细胞形成骨的研究进展进行综述，为颅骨缺损病变(尤其是小儿颅骨缺损)的修复提供新的临床治疗思路和方法。

1 LncRNA的结构与功能及来源

1.1 结构与功能 LncRNA是长度大于200个核苷酸序列、没有蛋白质编码作用的RNA(non-coding RNA,ncRNA)，其分子结构复杂，外显子少，表达量低，缺少开放阅读框(open reading frame，ORF)及典型的起始和终止密码子。大多数真核细胞的LncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ产生的；但小鼠热休克诱导的B2-SINE RNAs[6]，或人类神经母细胞瘤相关的NDM29[7]是由RNA聚合酶Ⅲ所合成。LncRNA可参与细胞的多种生理过程，包括染色质结构的调节、信使RNA翻译的控制、基因转录的调节、胚胎多能性的调控和分化。在成骨细胞中，大多数LncRNA保留在细胞核中发挥作用，如LncRNA-NRON[8]；但有研究发现某些LncRNA在细胞质中起作用，如lnc-DC[9]；还有一些调节性RNA在特定信号或刺激下从胞核向胞质传输类似的RNA，如反义泛素羧基末端水解酶L1(如UCHL1)LncRNA-UCHL1[10]。

1.2 来源 LncRNA主要有5种来源[11-12]：(1)由于某种原因导致编码蛋白质的基因出现断裂产生；(2)由于一个基因序列与尚未转录的两个基因序列发生重组产生；(3)由于非编码蛋白质基因复制时发生反转录而产生；(4)由于相邻的复制子串联而产生；(5)由于新的转座子嵌入基因序列产生。按照LncRNA在基因组上对应蛋白质编码基因的区域，可将LncRNA分为5类：(1)正义LncRNA；(2)反义LncRNA；(3)双向LncRNA；(4)内含子LncRNA；(5)基因间LncRNA。

2 LncRNA与成骨分化过程的相关信号通路

2.1 Wnt/β信号通路 β-catenin是经典Wnt信号通路中调节成骨分化的关键因子[13]，Wnt/β信号通路可通过调节成骨细胞的分化、增殖及功能，直接影响多能干细胞向成骨细胞分化，而且在脂肪细胞及前脂肪细胞定向分化为成骨细胞的过程中同样发挥关键作用。LncRNA作为一种竞争性内源性RNA，与microRNA相互竞争而抑制或促进其靶基因Fox O1的表达，进而影响骨形成过程Wnt信号通路中的关键因子β-catenin的表达，促进或抑制成骨过程。

Chen等[14]研究发现，在人髓核细胞(nucleus pulposus cell，NPC)中，LncRNA TUG1通过调控Wnt/β信号通路，提高β-catenin、Caspase-3、Bax、MMP-3的表达水平，下调Bcl-2和蛋白多糖的表达，进而抑制NPC凋亡和衰老，促进细胞增殖及成骨细胞分化。Liang等[15]研究证实，LncRNA H19正向调节成骨细胞分化，其稳定表达显著加速了成骨细胞的体内外分化；同时LncRNA H19的表达水平在人间充质干细胞(human mesenchyma stem cells，hMSCs)成骨过程中明显上调；另外，β-catenin是成骨负调控因子MiR-141和miR-22的常见靶点，H19通过对抗这两个microRNA的功能并导致共同目标基因的去抑制，最终激活Wnt/β-catenin通路，从而促进成骨分化。因此，LncRNA H19主要是通过拮抗miR-22和miR-141的功能，最终激活经典的Wnt/β-catenin信号通路促进体内和体外成骨，并增强成骨作用。然而，关于LncRNA p21对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的影响研究中显示，沉默LncRNA p21后，通过调节Wnt/β信号通路能促进BMSCs旁分泌血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和β-catenin蛋白表达，进而促进BMSCs向成骨细胞的分化[16]。因此，控制LncRNA表达可能是治疗由Wnt/β信号通路异常引起的成骨分化不良的有效方式。

2.2 TGF-β/BMP信号通路 TGF-β/BMP信号通路可通过经典的Smad通路与非经典的P38通路调控BMSCs内Runx2基因的表达，进而调控BMSCs向成骨细胞分化；同时其还能调节成骨细胞的分化和功能[17]。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一种多功能蛋白质，属于TGF-β超家族中的一员，具有多种生物学功能，可参与调节体内多种细胞的增殖、分化和凋亡。BMP最初由Urist发现，并证明BMP具有诱导骨、软骨形成及皮下、肌肉等部位异位骨形成的作用[18]。有研究表明，BMP2活化后可以直接作用于下游的Smad5，进而激活Smad5发生磷酸化，之后与Smad4形成复合体并转移到细胞核内，最终调控下游转录因子Runx2和OSX的表达，影响干细胞的成骨分化[19]。

Li等[20]研究发现，LncRNA Bmncr通过维持细胞外基质蛋白纤维调节蛋白(fibromodulin，FMOD)和激活BMP2通路来调节BMSCs的成骨生态位；进一步分析发现，Bmncr可作为促进TAZ与ABL相互作用的支架，从而促进TAZ与RUNX2/PPARG转录复合物的组装，增强成骨作用，抑制脂肪生成；另外，敲除Bmncr的小鼠出现骨质流失加速和骨髓脂肪积累，同时成骨相关基因Bmp2、碱性磷酸酶1(alkaline phosphatase 1，ALPl)、Runx2、Sp7和Bglap的表达也下调；而转基因过表达Bmncr可缓解骨质流失、抑制脂肪堆积。

miR-17-5p通过直接靶向BMP2调控人脂肪干细胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)的成骨分化。在非创伤性股骨头坏死中miR-17-5p通过靶向SMAD7调控成骨细胞分化和增殖[21]。LncRNA HOTAIR与miR-17-5p共享互补序列，HOTAIR通过介导miR-17-5p的表达来调控成骨分化标志物；HOTAIR下调可导致BMP-2诱导的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cell-bone marrow，hMSC-BM)的RUNX2和COL1A1 mRNA表达水平增加，ALP活性升高；进一步的实验证实，miR-17-5p模拟物可以逆转HOTAIR上调引起的RUNX2和COL1A1 mRNA表达水平的降低及ALP活性降低，而miR-17-5p抑制剂也可以抵消HOTAIR下调引起的RUNX2和COL1A1 mRNA表达水平及ALP活性的升高[22]。因此，HOTAIR作为骨分化的重要调节因子，通过调控miR-17-5p及其靶基因SMAD7的表达，调控成骨细胞分化和增殖的过程。

此前Zhuang等[23]研究发现，LncRNA MEG3在BMSCs的在成骨分化过程中起正调控作用，而在成脂分化过程中起负调控作用；其直接与SOX2和BMP4启动子相互作用，控制SOX2与BMP4启动子上SOX2共识位点的相互作用，增加BMP4基因的表达；MEG3过表达可通过靶向BMP4转录促进多发性骨髓瘤的间充质干细胞(multiple myeloma-mesenchymal stem cells，MM-MSCs)成骨分化，而MEG3的下调显著降低了BMP4的转录，导致成骨功能受损。另外在比较了MSC成骨诱导分化前后的差异LncRNA后，发现LncRNA H19可以通过H19/MiR-675/TGF-β/Smad/HADC通路促进成骨分化[24]。

2.3 PI3K/AKT信号通路 PI3K/AKT信号通路是一种广泛存在于多种组织中的与细胞增殖、分化、凋亡等密切相关的信号转导通路。在对鼻咽癌的研究中观察到，LncRNA ZFAS1在鼻咽癌组织和细胞系中表达上调；在体外ZFAS1可通过激活PI3K/AKT信号通路促进鼻咽癌细胞增殖。上调LncRNA DLX6-AS1表达通过调节PI3K/AKT/mTOR通路促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移[25]。而且越来越多的研究表明PI3K/AKT通路可能影响成骨分化[26]。Wu等[27]统计分析和实验结果证实，LncRNA HIF1A-AS2和IL-6在成骨诱导的脂肪源间充质干细胞(adiposederived stem cells，ASCs)中高表达；HIF1A-AS2激活了包含IL-6受体的PI3K/AKT信号通路，促进成骨分化；而HIF1A-AS2/IL-6的下调降低了成骨细胞标志物Runx2、Osterix和骨钙素的表达以及ALP的活性，使成骨功能受损。另外，在分子水平上，miR-665抑制IL-6表达，HIF1AAS2直接靶向miR-665，导致IL-6增加并激活PI3K/AKT信号通路，进一步促进成骨分化。因此，HIF1A-AS2/miR-665/IL-6轴共同调控PI3K/AKT信号通路参与成骨分化过程。

2.4 Notch信号通路 Notch基因编码一种膜蛋白受体，参与囊泡运输，并介导蛋白相互作用和化学修饰；Notch可以影响细胞形态发生的多个过程，如凋亡、增值分化及边界的形成等。Notch信号通路主要由Notch配体，Notch受体和细胞内效应子结合蛋白组成，Notch信号通路的激活主要取决于Jagged1配体与Notch1受体之间的结合，在细胞发育和分化中起关键作用。Jin等[28]研究发现，Notch信号通路参与了成骨细胞的生理活动，如增殖、侵袭和凋亡的调控。Wang等研究[29]显示，通过上调Notch信号通路中的Notch1表达并激活Notch信号通路可以明显促进骨肉瘤细胞的生长和增殖。

2.5 Hedgehog信号通路 Hedgehog(Hh)信号分子是一种由信号细胞所分泌的局域性蛋白质配体，其蛋白质家族在胚胎发育和细胞增殖中具有至关重要的功能。Hh信号通路已被公认为是各种癌症中的重要信号通路和治疗靶标。LncRNA嗜酸性粒细胞遗传学转录物(eosinophil genetic transcript，EGOT)可以抑制神经胶质瘤细胞的增殖和迁移，并通过Hh信号通路促进胃癌的发生和发展，还可能通过Hh途径失活而抑制乳腺癌细胞的通行性和迁移[30]。LncRNA ASAP1-IT1通过Hh信号通路正调控胆管癌的发展[31]。有研究发现，通过Wnt/β-Catenin激活间充质干细胞中Hh信号能够诱导软骨和骨肿瘤形成[32]。Runx2对于成骨细胞分化和软骨细胞成熟至关重要。在成骨细胞分化过程中，Runx2通过直接调控Hh、Wnt来增强间充质细胞的增殖并诱导其对成骨细胞分化。以上研究结果均表明Hh信号通路在骨的生长代谢中具有重要的作用。

3 LncRNA的临床应用

LncRNA参与人体正常生命活动及影响多种疾病的发生发展。有研究发现，LncRNA Hulc在乳腺癌组织中表达水平增高，miR-9-5p在乳腺癌组织中的表达下调；LncRNA Hulc和miR-9-5p的表达均与乳腺癌患者的不良病理参数相关，且对淋巴结转移有一定的预测价值。LncRNA Hulc、miR-9-5p可能为临床治疗乳腺癌提供新的靶点[33]。同时张向阳在细胞水平的实验证明，通过调节Myc、Lnc-EPIC1表达可以保护人成骨细胞免受地塞米松的损伤[34]。

总之，LncRNA在骨相关性疾病及调控骨重建中发挥了重要作用，但其相关机制尚未完全明确，仍需要大量基础研究探讨。目前对于LncRNA调控骨重建的研究还处于探索阶段，尤其是LncRNA如何调节成骨细胞及破骨细胞分化还有待进一步研究。因此，明确LncRNA作用机制具有十分重要的意义，通过各种手段干预相关特异性的LncRNA在成骨细胞及破骨细胞分化中的作用，可为颅骨修补(尤其是小儿颅骨缺损修补)的治疗提供新的方向。