22个木槿品种花粉形态与分类研究

赵艺璇 冯琪 田琳 张家培 王鑫 刘易超 刘冬云

摘 要： 为研究木槿（Hibiscus syriacus）不同品种花粉形态的多样性及其亲缘关系，该研究以22个木槿品种的花粉为材料，通过扫描电镜进行形态特征及外壁纹饰观测，然后使用R型聚类分析法和主成分分析法提取合适的指标进行UPGMA聚类分析。结果表明：（1）木槿的花粉均为单粒近球形，直径为148.98～111.65 μm;表面具有刺状纹饰，长度为27.42～14.79 μm，刺先端较尖，细刺周围均匀分布散孔;花粉表面分布有颗粒状突起，萌发孔性状不规则。（2）对测量指标提取主成分后进行 UPGMA聚类分析，当欧氏平均距离阈值为6时，22个木槿品种被分为6大类，单瓣蓝紫色品种‘蓝鸟、‘单瓣紫粉、‘细叶等亲缘关系较近，半重瓣品种‘薰衣草雪纺、‘中国雪纺、‘粉色雪纺等亲缘关系较近，而‘木桥、‘汉帛等粉白色单瓣木槿品种亲缘关系相对较近。该研究认为木槿种内蓝紫色品种相对较为原始，白色半重瓣品种次之，紫色半重瓣品种相对较为进化，白色单瓣品种进化程度更高。该研究结果为木槿种内遗传演化、分类地位以及亲缘关系的鉴定提供了依据。

关键词： 木槿， 扫描电镜， 花粉形态， 主成分分析， 聚类分析

Abstract： In order to study the morphological diversity of Hibiscus syriacus cultivars and their relationships， we observed morphological characteristics and exine sculpture of 22 H. syriacus pollen grains by scanning electron microscope， and used R-type cluster analysis and principal component analysis to extract appropriate indicators for UPGMA cluster analysis. The results were as follows： （1） The pollen of H. syriacus was single-spherical， nearly spherical with diameter of 148.98-111.65 μm with thorn-like ornamentation on the surface with length of 27.42-14.79 μm; The tip of the thorn was sharp， and the thorns distributed around scattered pores; The pollen surface was distributed with granular protrusions and the apertures were irregular. （2） UPGMA cluster analysis was performed after extracting principal components of the measured indicators. When the Euclidean mean distance threshold was 6， 22 H. syriacus cultivars were divided into six categories. The single-petal blue-violet cultivars ‘Bluebird， ‘Dan Ban Zi Fen and ‘Xi Ye had close relationships， and semidouble cultivars ‘Lavender Chiffon and ‘China Chiffon， ‘Pink Chiffon had close relationships， while white single-petal ‘Wood Bridge and ‘Hamabo were relatively close. It was believed that the single-petal blue-violet cultivars in H. syriacus were more primitive than the pink and white semidouble cultivars， while purple semidouble cultivars were more evolved and the white single-petal cultivars were highly evolved. The results of this study provide theoretical basis for genetic evolution， taxonomic status， and genetic relationship studies in H. syriacus.

Key words： Hibiscus syriacus， scanning electron microscope， pollen morphology， principal component analysis， cluster analysis

木槿（Hibiscus syriacus）是我國园林绿化常用的灌木或小乔木。木槿花色繁多有纯白、米黄、紫色、粉色、红色等，瓣型有单瓣、半重瓣、重瓣三类，花期极长，可在6—10月连续开花，弥补了我国北方园林绿化中夏季至秋季缺少开花木本植物的不足（刘小冬等，2008）。木槿品种繁多，欧美国家和韩国已培育出200余个品种，常用于欧美园林的有40余种，但我国对于木槿分类和繁育工作研究较少，缺乏系统深入研究，长时间以来，由于不断的人工杂交和自然选择，使得木槿品种关系混乱，来源不明，亲缘关系模糊，分类与进化关系难以确认。因此，研究木槿品种分类、亲缘关系对于木槿品种间杂交，培育新品种具有重要意义。

不同植物的花粉形态差异较大，可以反映出植物的遗传差异性。在遗传基因的控制下，花粉形态具有保守、可靠和稳定的特性（黎怀成等，2018）。国外进行了有关锦葵科植物的胞粉学研究，EL Naggar （2004）研究了锦葵科10个属21种植物的花粉形态，Bibi et al.（2010）研究了锦葵科6个属下9个种的花粉形态，均认为锦葵科植物花粉的形态性状、花粉外壁表面纹饰对本科内物种划分有很大的参考价值。近年来关于其他科属植物种内花粉形态研究均发现不同种质间花粉形态具有一定差异，可作为划分品种，进行品种间亲缘关系研究的重要依据（罗乐等，2017;张锐等，2018;刘秀丽等，2018）。因此，进行花粉形态观察，进行孢粉学标记研究对于研究植物品种遗传多样性及亲缘关系具有重要意义。

为了研究木槿品种间亲缘关系，本试验以22个木槿品种的花粉为材料，通过扫描电镜观察测量其形态差异，根据测量结果进行聚类分析，进而探讨木槿种内亲缘关系，旨在为木槿品种分类和亲缘关系研究提供孢粉学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取22个品种木槿的成熟花粉为供试材料，品种名称及来源详见表1。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集及不同储藏方法处理 选择健康无病虫害的木槿样本，采集新鲜花粉，加入4%戊二醛溶液浸泡，储存于4 ℃冰箱中等待检测（Erdtman， 1978）。每品种采集3个不同单株花朵的花粉，重复3次。

1.2.2 脱水预处理 电镜观察前，取出待测储藏花粉。先用去离子水浸泡3次，时长分别为6、7、8 min，再经过50%乙醇14 min→70%乙醇14 min→85%乙醇14 min→95%乙醇15 min→100%乙醇15 min逐级脱水处理。

1.2.3 干燥处理 先打开二氧化碳临界点干燥仪气阀，制冷到10 ℃，放入试验样品，充入CO2液体，静置27 min后放出CO2液体，这个步骤重复3次;再次充入CO2液体，加热45 min后关闭总气阀，等待气体全部缓慢放出之后，取出处理后的试验样品。

1.2.4 电镜观察 对木槿花粉进行喷金处理后使用HITACHI SU8010扫描电镜观察。选取典型花粉粒进行拍照，在×200视野下拍摄花粉群体图像，在×500视野下拍摄花粉个体图像，在×3 000下拍摄花粉局部图像。

1.2.5 数据分析 参考彭焕文等（2018）和刘金兰等（1987）的方法，测量不同花粉直径、刺状凸起长度、两刺间距离等花粉形态指标。

使用SPSS 22.0根据Tukey检验法对测量指标进行显著性检验。以最小值和最大值表示变异幅度。变异系数（CV）%=S×100%x，其中，S为标准差。根据计算所得平均值对所选指标进行R型检验，提取主成分并将所得主成分作为因子进行UPGMA聚类方法分析。

2 结果与分析

2.1 花粉的基本特征

根据彭焕文等（2018）和刘金兰等（1987）对锦葵科植物花粉形态分类所使用指标进行测量，分析22个木槿样本花粉电镜扫描结果。如图版Ⅰ所示，22个木槿品种的花粉形态为单粒近球形，表面分布刺状纹饰，刺为圆锥形，先端钝圆，细刺周围均匀分布散孔。花粉表面分布有颗粒状突起，萌发孔形状不规则，细刺脱落后，萌发孔暴露于花粉表面。

2.2 花粉的大小

总体而言，木槿花粉均以单粒近球形形式存在，平均直径为122.54 μm，直径这一指标变异系数为1.01%。其中，‘法国紫色酒馆直径最大，为148.98 μm;‘蓝鸟直径最小，为111.65 μm。

2.3 花粉外壁纹饰特征

22种木槿花粉表面均分布有刺状纹饰，刺状纹饰粗细大小不一，且在花粉表面分布状况各不相同，具体结果见表2所示。细刺平均长度为21.18 μm，变异系数为1.56%;‘单瓣紫粉刺长最长，为27.42 μm;‘蓝色雪纺刺长最短，为14.79 μm;22个品种刺基部宽度为10.44 μm，变异系数为1.79%;‘薄荷基部宽度最大，为13.26 μm;‘紫柱基部宽度最小，为6.84 μm;22个木槿品种瓣紫粉花粉直径/刺长比值最小，其刺状突起相对较长;从各指标变异系数来看，该指标变异系数最大，为2.24%（图版Ⅱ-Ⅳ）。

2.4 22个木槿品种6个花粉形态R型聚类分析和主成分分析

R型聚类分析可分析所选取指标之间有无相关性，从而选取代表性强的性状指标进行下一步分析。由图1 R型聚类分析结果可知，图中各性状指标较为分散，说明选取指标较为合理，可用于下一步Q型聚类分析。对测定的6个木槿花粉外壁形态指标提取主成分，进行主成分分析。由表3和表4結果可知，测定的6个形态指标可以被划分为2个主成分。第1主成分包括刺长、花粉直径、刺长/刺基部宽和花粉直径/刺长4个指标。其中，贡献率较大的为花粉直径/刺长和刺长/刺基部宽2个指标;第2主成分包括刺基部直径和两刺距离2个指标。这6个指标累积贡献率可达77.611%，说明可以较为完整地反映出木槿花粉外壁形态指标信息。综合R型聚类分析结果和主成分分析结果来看，选取的6个形态指标具有代表性，可用于对木槿花粉进行Q型聚类分析。

2.5 22个木槿品种花粉外壁形态的聚类分析

根据这6个指标对22种花粉进行Q型聚类分析。由图2可知，欧氏平均距离阈值为6时，22个木槿品种被分为6大类，第1类仅‘蓝色雪纺，第2类仅‘薄荷1个品种，这两类花粉形态具有刺基部相对较宽、花粉直径和花粉直径/刺长值较大的特点;第3类包含‘蓝鸟1个品种;第4类包含‘单瓣紫粉1个品种，该品种花粉刺长较短，刺基部宽，两刺距离较长，花粉直径较大，刺长/刺基部宽值较小，花粉直径/刺长值较大;第5类包括‘紫柱、‘细叶、‘粉红巨人和‘胭脂红4个单瓣粉紫色木槿品种，第5类花粉中4个品种木槿花粉刺长/刺基部宽值均相对较大;第6类花粉刺长/刺基部宽值相对较小，花粉直径/刺长值相对较大，主要包括‘红心、‘汉帛、‘木桥等粉白色单瓣品种， ‘法国紫色酒馆、 ‘玫瑰、 ‘薰衣草雪纺3个紫色半重瓣品种以及‘粉色雪纺和‘中国雪纺2个粉白色半重瓣品种。

3 讨论与结论

3.1 关于木槿花粉系统进化特征

花粉体积越小，对植物体营养竞争越小，进化程度越高（周守标等， 2005;杨晨漩等，2014）。22种木槿花粉直径范围为148.98～111.65 μm，属于大粒花粉。花粉壁表面纹饰特征可以反映植物进化规律，一般来说，花粉表面平滑的较为原始，其次为花粉表面为颗粒状突起，再到棒状、刺状，最终演化为网状、皱波状及条纹状。花粉进化趋势为大型表面粗糙到小型表面光滑。综合来看，木槿花粉为大粒近球形花粉，花粉萌发孔属于单一的不规则萌发孔，且表面均分布有粗细长短不一的刺状纹饰，属于进化程度较低的植物类群。

3.2 关于木槿在锦葵科内进化地位

花粉形态受遗传基因控制，具有稳定性，受外界环境因子影响较小，因此孢粉学标记可用作植物分类和亲缘关系分析的重要依据。在分类水平较高的科与亚科之间，花粉形态差异较大，而在同科不同属中，各种之间差异较小，而各品种之间遗传差异则更小，相似点更多。前人已有研究表明，在锦葵科内，花粉外壁纹饰进化趋势为从中等大小到体积增大，从3孔沟到多散孔，从基部膨大短尖刺到基部平长尖刺（孙京田等，1993;El Naggar， 2004;El Nauuar & Sawady， 2008;彭焕文等，2018）。本试验中所观察木槿品种体积较大，表面分布有不规则散孔，刺细长且基部平坦，符合锦葵科内较进化种的花粉外壁纹饰特征，因此，木槿在本科内属于进化程度较高的类群。

3.3 关于木槿花粉形态研究的分类学意义

根据 R型聚类分析和主成分分析得出的6个木槿花粉外壁形态指标对22个木槿品种进行聚类分析是对变量进行分类处理。本研究发现，木槿花粉聚类分析结果与其花形态指标有一定的相关性。在第5类中，单瓣蓝紫色品种‘蓝鸟、‘单瓣紫粉、‘细叶、‘粉红巨人单独聚为一类，说明花粉形态特征与其花色花型具有一定相关性。肖芬等（2019）利用形态学标记、孢粉学标记及ISSR分子标记对27个木槿品种亲缘关系进行了综合分析，得出27个木槿品种形态学、孢粉学以及ISSR分子标记分析结果具有一定相似性，与本试验研究结果具有一致性。张铮和史刚荣（2009）从木材解剖学角度研究了5个品种木槿进化关系，该研究认为，紫花单瓣木槿属于最为原始的类群，紫花单瓣木槿在分化出牡丹木槿的基础上再分化出了紫花重瓣木槿。在本研究中，当欧氏平均距离阈值为3时，木槿与半重瓣品种‘薰衣草雪纺、‘中国雪紡和‘玫瑰聚为一类，而‘薰衣草雪纺、‘中国雪纺、‘玫瑰和牡丹木槿在形态上具有高度相似性，均属于粉色半重瓣品种，说明这3个品种是紫色单瓣木槿最初分化得来的，相对较为原始。粉白色单瓣品种如‘木桥、‘汉帛、‘红心遗传关系较近，但和木槿遗传关系相对较远，说明此花型品种相对较为进化，由此推测较其他花型品种来说，白色单瓣品种进化程度相对较高。由于木槿是本种的原种，而木槿与其他单瓣蓝紫色品种遗传关系较近，因此本研究认为木槿种内蓝紫色品种相对较为原始，白色半重瓣品种次之，紫色半重瓣品种相对较为进化，白色单瓣品种与木槿遗传关系较远，相对于其他花形态的木槿进化程度更高。木槿花粉形态与其花形态存在一定联系，而花形态可能会受外界环境因子影响，两者可共同作为木槿系统分类标准。

总体而言，木槿属于相对较为原始的类群，但在锦葵科内，木槿属于较为进化的类群，其花粉形态与花色花型具有一定的相关性。花粉外壁纹饰受基因控制，具有一定的稳定性（赵娜，2014），但单凭孢粉学作为判断品种间亲缘关系及分类依据，还不够全面，存在一定局限性，在今后研究中需要结合形态学标记、分子标记等多方面研究对其进行综合分析。

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（责任编辑 李 莉）