响应面优化血根碱β-环糊精包合物的制备工艺

梁浩 钱玺丞 杜晓静 郁建生

摘    要：本研究旨在制备血根碱β-环糊精包合物，从而拓宽其应用范围。首先通过单因素试验对条件进行优化，随后再以包合率考察指标，采用响应面法对包合比、包合温度、包合时间3个因素进行优化，确定最佳的工艺参数。结果表明：包合时间140 min，包合比7∶1，包合温度62 ℃时包合率达到56.05%，与软件预测值（56.11%）接近（相对误差0.11%）。

关键词：β-环糊精;血根碱;响应面分析法

中图分类号：TS201.1          文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.02.001

Response Surface Optimization of the Preparation Process of Sanguinarine β-cyclodextrin Inclusion Compound

LIANG Hao， QIAN Xicheng， DU Xiaojing， YU Jiansheng

（Key Open Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine， Tongren Polytechnic College， Tongren，Guizhou  554300， China）

Abstract： This study aims to prepare sanguinarine β-cyclodextrin inclusion compound to broaden its application range. Firstly， the conditions were optimized through single factor test， and then the indicators were investigated by inclusion rate. The response surface method was used to optimize the inclusion ratio， inclusion temperature， and inclusion time to determine the best process parameters.The results showed that when the inclusion time of the inclusion reaction was 140 min， the inclusion ratio of β-cyclodextrin and sanguinarine was 7∶1， and the temperature of the inclusion reaction was 62 ℃， and the inclusion rate reached 56.05% ， which was close to the software predicted value （56.11%） （relative error 0.11%）.

Key words： β-cyclodextrin; Sanguinarine; response surface methodology

血根碱是一种苯并菲啶型的异喹琳类生物碱，主要存在于紫堇的根块、血水草的地上部分以及白屈菜和博落回的全草之中[1-8]。研究表明具有多种药理活性（抗肿瘤、抗炎、抗菌等）[9-11]，在生物医药、兽药和植物源生物农药方面应用广泛[12-18]。此外，血根碱还具有一定的清除自由基功能，因此可作为一种潜在的天然食品抗氧化剂[19]。但由于血根碱在水中的溶解度和稳定性较差，限制了其应用范围。环糊精包合技术能很好地解决这一难题，不仅可以增加客体分子的水溶性，还可以降低其自身的毒性，掩盖其苦味，防止客体分子在加工和贮存过程中变质等[20]。目前苯并菲啶型生物碱的环糊精包合物主要集中在对小檗碱的包合，以掩盖其苦味，对血根碱的包合作用研究较少[21-24]。因此，本试验主要研究了β-环糊精对血根碱的包合作用，以期改善其溶解性和稳定性，从而拓宽其应用范围。

1 材料和方法

1.1 试验材料与仪器

血根碱原料（HPLC检测纯度为95.5%），参照文献[25]自制，血根碱标品（纯度≥98%;上海源叶生物科技有限公司）和β-环糊精（纯度≥98%;上海源叶生物科技有限公司）;其它常规试剂为分析純购自国药试剂。

超高效液相色谱仪（型号：Agilent1290）购自安捷伦;真空干燥箱（型号：FZG-1）购自南京华莎;十万分之一分析天平（型号：CPA225D）购自赛多利斯;千分之一分析天平（型号：AE224）购自上海舜宇;磁力搅拌器（型号：DF-101S）购自巩义予华;紫外可见分光光度计（型号：T10CS）购自北京普析;超声波清洗机（型号：SG5200HE）购自上海冠特;鼓风干燥箱（型号：DHG-9140B）购自上海福絮。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 溶液制备：称取10.29 mg血根碱标准品，用甲醇-1.0%盐酸溶液（50∶50）溶解，超声30 s，采用100 mL容量瓶定容，配置得到血根碱标准溶液母液。准确量取标准品母液1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL于容量瓶（50 mL）中，并定容。

色谱条件：ZORBAX Eclipse Plus C18 型超高压快速高分离度窄径柱（2.1*50， 1.8 μm）色谱柱，波长271 nm;流动相0.1%磷酸-乙腈;柱温25℃;进样量 2 μL;流速 0.5 mL·min-1。

标准曲线绘制：横坐标X轴为血根碱浓度，纵坐标Y轴为峰面积，绘制标准曲线（图1）。该曲线在 0～20 μg·mL-1范围内线性关系良好，回归方程为Y=-0.589 14+14.956 9x，R2=0.999 93。

1.2.2 血根碱-β-环糊精包合物制备 称取一定量β-CD，加入5 mL蒸馏水，水浴加热搅拌至溶解，缓慢加入0.1 g血根碱，避光搅拌，搅拌结束后将反应液冷藏过夜，过滤反应液，滤饼用蒸馏水洗涤，滤饼40℃真空干燥，粉碎后即得包合物粉末。

1.2.3 血根碱β-环糊精包合单因素试验 包合温度：固定反应的包合时间和包合比，以包合率为指标，包合温度分别30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，确定较佳包合温度。

包合时间：固定反应的包合比和包合温度，以包合率为指标，包合时间分别1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，确定较佳包合时间。

包合比：固定反应的包合时间和包合温度，以包合率为指标，包合比分别1∶1，2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，确定较佳包合比。

1.2.4 包合物制备工艺的响应面优化 结合单因素试验结果，以血根碱包合物包合率（Y）为评价指标，考察包合比（X1）、包合时间（X3）和包合温度（X2）这3个因素，通过优化Box-Behnken响应面分析确定最佳的血根碱包合参数，试验设计中的水平及编码值见表1。

1.2.5 样品溶液的配制及含量测定 准确称取血根碱包合物，采用1.0%盐酸-甲醇溶液（50∶50）溶解，超声30 s，定容于25 mL容量瓶中，摇匀，采用有机溶剂微孔滤膜（0.22 μm）过滤，得待测包合物样品溶液。采用高效液相色谱法（检测波长271 nm）测定包合物中血根碱含量。血根碱包合率= 1-（滤液中血根碱质量+包合物中未反应血根碱质量）/称量血根碱质量×100%。

1.2.6 数据处理与分析 单因素试验均重复3次取平均值，试验数据采用OriginPro 9.1 软件进行统计与分析，响应面试验数据采用Design-Expert 8.0.6.1软件统计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 β-环糊精与血根碱的配比对包合反应的影响 采用单因素方差分析通过包合比对包合率影响的试验数据显著性分析得P=0.009 4达到极显著水平（P<0.01），由图2可知，血根碱的包合率随β-环糊精与血根碱的包合比的增大而增大，当包合比为6∶1时包合率达到最大值38.6%，继续增大包合比，包合率减小，因此选择包合比为6∶1。

2.1.2 搅拌反应温度对包合率的影响 采用单因素方差分析通过包合温度对包合率影响的试验数据显著性分析得P=0.005 7达到极显著水平（P<0.01），由图3可知，包合温度较低或较高时包合比都会降低，可能是温度较低不利于血根碱进入环糊精内部的空腔结构，温度过又会导致已经形成的包合物分解。因此选取包合温度为60℃。

2.1.3 包合时间对血根碱包合率的影响 采用单因素方差分析通过包合时间对包合率影响的试验数据显著性分析得P=5.24×10-6达到极显著水平（P<0.01），由图4可知，包合时间过长或过短时均不利于包合物的形成，当包合时间为2 h时包合率达到最大值，可能是由于包合时间缩短血根碱的包合反应过程尚未完成，时间太长又会导致以形成的包合物脱包合。因此选择2 h为包合时间。

2.2 响应面试验

2.2.1 试验结果与分析 响应面试验数据采用Design-Expert8.0.6.1软件分析，试验结果见表2，建立数学模型方程為：Y=53.44+2.78X1-0.23X2+4.25X3+2.52X1X2+4.43X1X3-0.34X2 X3-3.60X12-3.15X22-6.34X32。

方差分析结果见表3。该模型P值达到极显著水平，二次项均显著，说明方程与试验拟合度较好。模型方差分析表明，各影响因素对血根碱的包合率影响次序为：包合时间>主客分子包合比>包合温度。

2.2.2 包合工艺的响应面交互作用分析 图5为β-环糊精与血根碱包合工艺的响应面分析图。由图5 可看出，X1和X3的交互作用对包合率影响极显著，X1X2和X2X3对包合率的影响不显著。根据响应面分析得到的最佳包和参数为包合比6.91∶1，包合时间2.32 h，包合温度61.82℃时包合率的理论最大值为56.11%。

2.2.3 血根碱与β-环糊精环糊精包合工艺验证试验 考虑到实际操作的局限性，因此将包合工艺的参数进一步修订，包合比修订为7∶1，包合时间修订为140 min，包合温度修订为62℃，将此条件重复三次取平均值，包合率达到56.05%与预测值相对误差为0. 11%。由此可知，理论值与实际值误差在± 1%以内，说明采用Box-Behnken组合优化得到的包合参数准确可靠，可以较好地反应β-环糊精与血根碱的包合情况，具有一定的应用价值。

2.3 血根碱包合物的紫外光谱分析

在200～400 nm波长条件下，分别对四种不同溶液（血根碱标准品溶液、β-环糊精样品溶液、包合物溶液、混合物溶液）进行紫外扫描，其紫外光谱如图6所示。由图可知，包合物的紫外吸收波峰和波谷与β-环糊精、血根碱以及两者的物理混合物的波峰和波谷的吸收波长均有所差异，因此可判定得到的不是血根碱与β-环糊精的简单混合物（不同物质的紫外吸收曲线波峰和波谷的位置均有差异），因而初步验证了血根碱-β-环糊精包合物已形成。

3 结论与讨论

近年来环糊精包合技术在制药工业中应用越来越多，经环糊精包合以后，不仅可以延长延误的货架期，改善药物的口感提高适口性。还可以提高药物的溶解度、生物利用度、控制药物的释放、还可以实现靶向治疗等[26]。目前环糊精对小檗碱的包合作用已被多人报到，经包合以后小檗碱的溶解性和苦味都有所改善，血根碱与小檗碱同属苯丙菲啶型生物碱，结构相似，因此环糊精对血根碱的包合作用应该也能实现。通过环糊精对血根碱的包合，以期改善其稳定性和溶解性。

本研究通过单因素试验确定了β环糊精和血根碱的包合比为6∶1，包合温度为60℃、包合时间为2 h。再通过用Box-Benhnken 设计3因素3水平的响应面试验，得到了β环糊精和血根碱的最佳包合工艺：包合比7∶1、包合温度62℃、包合时间140 min，包合率达到56.05%。经紫外光谱初步鉴定，包合物已形成，本试验通过响应面优化得到的试验数据可靠，理论值与实际值相差不大，因此该工艺具有很好的应用价值，可为血根碱新型制剂的开发提供技术支持。

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