针刺结合蹊径通脉汤对心肌梗死大鼠瞬时外向钾离子通道相关蛋白持续表达的研究

2021-03-24邸静鑫金颂峰

海南医学院学报 2021年5期

邸静鑫，王颖，金颂峰

（辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847）

近年来，我国每年至少新发心肌梗死患者50万例［1］，其发展迅速、十分危急，严重影响患者生活质量甚至可以导致死亡，并且发病人群逐渐由中老年人转向中青年，已严重危害我国居民的生命健康［2］。所以探索出一种方便、持续、有效的治疗方案已在临床中引起高度重视。冠状动脉粥样硬化可以引起心肌缺血，而心肌梗死是心肌缺血的最严重表现，因此改善缺血症状可以有效治疗心肌梗死。前期实验研究发现［3］，针刺疗法可以有效上调大鼠心肌细胞中瞬时外向钾离子通道相关蛋白表达，从而改善心肌的缺血状态，实现对心肌梗死的治疗作用。目前，虫类药物已被越来越广泛的应用与在心肌梗死的治疗中［4～6］。因此，本研究拟在前期工作基础上，将针刺疗法与以虫类药为主的蹊径通脉汤相结合，观察其对心肌梗死大鼠瞬时外向钾离子通道相关蛋白的持续表达情况，并探讨其疗持续效情况及可能的持续作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

130只健康雄性SD大鼠，体质呈（250±25）g，伦理批号：21000092018010，实验过程均严格按照实验动物伦理规范化操作［长生生物，许可证号：SCXH（辽）2015-0001，使用编号：SYXK（辽）2013-0009］。

1.2 实验药物与试剂

蹊径通脉汤：水蛭15 g、蜈蚣2条、白僵蚕15 g、土鳖虫25 g、降香20 g、麦冬25 g、石菖蒲30 g、牛膝20 g、茯苓25 g、丹参30 g、当归25 g、川芎25 g、甘草5 g，由辽宁省中医院制成含生药5.5 g/mL的中药浓缩液。阿司匹林肠溶片（Bayer，国药准字J20171021），单硝酸异山梨酯（Lu⁃nan，国药准字H10940039），异丙肾上腺素（SIGMA，I5627-5G）。高脂饲料［科澳协力，许可证号：SCXK（京）2019-0001］。

1.3 主要仪器

心电监护仪（HP）；生物机能实验系统（泰盟科技，BL-420S）；针灸针（Hwato，0.18 mm×25 mm）；超低温冰箱（SANYO）；EPS300 电泳仪（天能科技）；SHA-B型恒温水浴振荡器（常州国华仪器设备厂）；蛋白电泳及转印系统（GE）；酶标仪（MD）；凝胶成像分析系统（Al⁃pha）等。

1.4 分组与造模［7］

所有大鼠适应性喂养7 d。随机抽取20只作为对照组，普通喂养，其余大鼠建立心肌梗死模型。具体造模方法如下：除对照组外，其余大鼠高脂饮食喂养，每只15 g/d。3周后，所有大鼠以10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。仰卧位固定大鼠，用生物机能实验系统描记大鼠正常状态下的Ⅱ导联心电图。然后除对照组外，其余大鼠注射盐酸异丙肾上腺素（85 mg/kg），对照组注射等量生理盐水。24 h后再次注射并进行心电图描记。当心电图出现T波由正变负或双相，并伴有ST段明显抬高、QRS波增宽、窦性心动过速、前期收缩等现象，即为造模成功。将造模成功的80只大鼠随机分为模型组、针药结合组、针刺组、西药组，20只/组。

1.5 实验方法

根据等计量比值表参照临床70 kg体重患者日服量进行折算［8］，共计给药15 d。（1）针药结合组：每日灌服蹊径通脉汤19.35 g·kg-1·d-1，并在心俞、内关、足三里三穴以平补平泻手法30°刺入皮下2 mm。大鼠稳定后施以2～20 Hz疏密波电针，以前肢出现与电针频率一致的轻微颤动为宜，15 min/次，每日一次，共计15 d。（2）针刺组：每日灌服等量生理盐水，针刺方法同针药结合组。（3）西药组：每日灌服阿司匹林9.00 mg/kg、单硝酸异山梨酯3.6 mg/kg，进行等时长绑缚。（4）对照组与模型组：每日灌服等量生理盐水，进行等时长绑缚。

1.6 标本采集

采集前夜禁食处理。腹主动脉取血，离心取上清液−20℃保存。取血完毕后立即处死大鼠，迅速分离心脏组织，−80℃超低温冰箱保存。

1.7 ELISA 法检测人碱性成纤维细胞生长因子（bF⁃GF）蛋白含量

按照要求稀释标准品，加样于酶标板上预设的各标准品孔、待测样品孔中。盖封板膜混匀，37℃温育60 min。揭去封板膜，弃去各孔中液体后加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干。每孔加入显色剂A、B各50 μL，震荡混匀，37℃避光显色10 min。各孔中加入终止液50 μL。利用酶标仪450 nm波长下依序测量各孔的OD值。计算标准曲线的直线回归方程，再根据样品OD值计算出对应的样品浓度。

1.8 Western Blot 法检测大鼠Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2蛋白表达量

用冰生理盐水冲洗干净心脏组织，将其尽量剪碎后与裂解液按1∶1 000比例混合，使其充分裂解后，以12 000 r/min，4℃离心10 min。Broadford蛋白浓度测定法测定蛋白浓度，配置凝胶进行电泳。将蛋白样品转移到膜上，封闭1 h。剪下目标蛋白，加入一抗，37℃水浴震荡1 h后4℃过夜。同样方法孵育二抗，洗膜。通过成像系统观察结果，以目标条带和内参条带灰度值的比值反映各蛋白表达。

1.9 统计学处理

所有数据采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠情况

（1）治疗开始前：除20只空白组大鼠外，共计造模成功80只，随机分组，20只/组。（2）治疗结束时：模型组存活18只，其余组无大鼠死亡。此时处死各组一半数量的大鼠取样，其余继续正常饲养30 d。（3）治疗结束30 d后：空白组10只，模型组6只，西药组7只，针刺组8只，针药结合组9只。

2.2 各组治疗结束及30 d后bFGF蛋白含量比较

（1）治疗结束时：相比对照组，其余4组bFGF蛋白含量升高（P＜0.05）；相比模型组，各治疗组bFGF蛋白含量升高（P＜0.05），相比西药组、针刺组，针药结合组升高更明显（P＜0.05）。（2）治疗结束30 d后：相比对照组，其余4组bFGF蛋白含量升高（P＜0.05）；相比模型组，各治疗组bFGF蛋白含量升高（P＜0.05）；相比治疗结束时，治疗结束30 d后各治疗组bFGF蛋白表达虽有些许回落（P＜0.05），但仍高于此时的模型组（P＜0.05），其中针药结合组回落最小（P＜0.05）。见表1。

表1 各组治疗结束及30 d 后bFGF 蛋白含量比较（ng/L，±s）Tab 1 bFGF protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

注：治疗结束30 d 后样本含量发生变化，此时对照组大鼠数量仍为10，模型组为6，西药组为7，针刺组为8，针药结合组为9。与同期对照组比较，*P ＜0.05；与同期模型组比较，#P ＜0.05；与同期西药组、针刺组比较，▲P ＜0.05；与同组治疗结束时比较，▼P ＜0.05。以下同。

30 d 后1.855±0.095 1.922±0.146*1.923±0.107*#▼1.955±0.130*#▼2.001±0.157*#▼▲12.332＜0.001组别 n 结束时对照组 10 1.891±0.120模型组 9 1.999±1.190*西药组 10 2.010±0.116*#针刺组 10 2.043±0.157*#针药结合组 10 2.085±0.199*#▲F 10.193 P＜0.001

2.3 各组治疗结束及30 d 后Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白含量比较

（1）治疗结束时：相比对照组，其余4 组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白含量降低（P＜0.05）；相比模型组，各治疗组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2蛋白含量升高（P＜0.05），相比西药组、针刺组，针药结合组升高更明显（P＜0.05）。（2）治疗结束30 d后：相比对照组，其余4 组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白含量降低（P＜0.05）；相比模型组，各治疗组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白含量升高（P＜0.05）；相比治疗结束时各治疗组，治疗结束30 d 后的各治疗组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白表达虽有些许回落（P＜0.05），但仍高于此时的模型组（P＜0.05），其中针药结合组回落最小（P＜0.05）。见表2～5，图1～4。

表2 各组治疗结束及30 d 后Kv1.4 蛋白含量比较（ng/L，±s）Tab 2 Kv1.4 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

组别 n 结束时对照组 10 1.695±0.101模型组 9 0.350±0.071*西药组 10 0.951±0.134*#针刺组 10 1.132±0.134*#针药结合组 10 1.314±0.093*#▲F 16.620 P＜0.001 30 d 后1.693±0.115 0.348±0.086*0.946±0.126*#▼1.129±0.113*#▼1.313±0.076*#▼▲18.253＜0.001

图1 各组治疗结束及30 d 后Kv1.4 蛋白条带Fig 1 Kv1.4 protein band of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment

表3 各组治疗结束及30 d 后Kv4.2 蛋白含量比较（ng/L，±s）Tab 3 Kv4.2 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

组别 n 结束时对照组 10 1.304±0.101模型组 9 0.484±0.122*西药组 10 0.766±0.128*#针刺组 10 0.778±0.115*#针药结合组 10 0.919±0.139*#▲F 15.382 P＜0.001 30 d 后1.300±0.154 0.481±0.117*0.760±0.143*#▼0.775±0.178*#▼0.917±0.149*#▼▲17.273＜0.001

图2 各组治疗结束及30 d 后Kv4.2 蛋白条带Fig 2 Kv4.2 protein band of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment

表4 各组治疗结束及30 d 后Kv4.3 蛋白含量（ng/L，±s）Tab 4 Kv4.3 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

组别 n 结束时对照组 10 3.060±0.272模型组 9 0.941±0.119*西药组 10 1.512±0.116*#针刺组 10 1.661±0.179*#针药结合组 10 2.004±0.114*#▲F 24.664 P＜0.001 30 d 后3.056±0.152 0.935±0.121*1.506±0.128*#▼1.657±0.134*#▼2.003±0.106*#▼▲26.041＜0.001

图3 各组治疗结束及30 d 后Kv4.3 蛋白条带Fig 3 Kv4.3 protein band of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment

表5 各组治疗结束及30 d 后KChIP2 蛋白含量（ng/L，±s）Tab 5 KChIP2 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

组别 n 结束时对照组 10 1.734±0.130模型组 9 0.464±0.145*西药组 10 0.747±0.128*#针刺组 10 0.940±0.135*#针药结合组 10 1.237±0.240*#▲F 19.254 P＜0.001 30 d 后1.731±0.112 0.462±0.125*0.741±0.112*#▼0.936±0.115*#▼1.236±0.138*#▼▲24.723＜0.001

图4 治疗结束及治疗结束30 d 后各组大鼠KChIP2 蛋白带Fig 4 KChIP2 protein band of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment

3 讨论

心肌梗死是临床上常见的危重疾病，是冠心病最主要的致死因素之一，其通常是在冠状动脉粥样硬化的基础上，发生冠脉供血减少或中断，使相应的心肌严重且持久缺血而引起［9］。因此，在心肌梗死的治疗中，改善冠状动脉的血流供应尤为重要。心肌梗死的发病症状与中医学的“胸痹”、“真心痛”极为相似，其主要表现为胸部闷痛、甚则胸痛彻背、短气喘息不得卧，多由劳累、饱餐、寒冷及情绪激动等诱发［10］。中医认为“胸痹”、“真心痛”多由嗜食肥甘，损伤脾胃，使脾失健运，胃失和降，水湿不化，可生痰浊。痰浊阻滞，致使经络瘀滞不通，气血凝滞，不通则痛，出现心胸憋闷疼痛。这与高血脂诱发的动脉粥样硬化病理形态相似，因此本实验选择痰瘀互结型心肌梗死模型，通过高脂喂养大鼠改变其饮食习惯，当脂代谢紊乱后，再用异丙肾上腺素诱导模拟临床心肌梗死发病过程制备心肌梗死模型［7］。

心肌梗死的主要病机为痰瘀互结、心脉痹阻，从而确立治疗原则为祛瘀化痰、通络宣痹。本实验拟在前期研究基础上，选取心俞、内关、足三里，与蹊径通脉汤结合应用，共同激发机体功能，保护心肌细胞，实现对心肌梗死良好而持久的治疗作用。心俞作为心的背俞穴，心脏经气转输之地，具有宁心定志、养血安神之功，可直接调节心功能，为临床中广泛应用的治疗心脏疾病的要穴［11］。内关是心包经的络穴、八脉交会穴，可宁心安神、理气止痛，改善心肌缺血、增强心功能，有效缓解心肌梗死的重度疼痛症状［12］。足三里作为胃经合穴，可调和气血、健脾和胃、加强正气抗邪能力，提高心血管腔壁压力感受器敏感性、改善心脏供血情况［13］。三穴合用，共奏活血化瘀、理气祛痰、通络止痛的功效。蹊径通脉汤中丹参、当归活血化瘀，主入血分，并以水蛭、土鳖虫活血通络，白僵蚕、蜈蚣化痰散结，此四味功用互补，力专效宏。叶天士在《临证指南医案》指出“藉虫蚁血中搜剔以攻通邪结”，表明虫类药长于活血化瘀、疏络逐邪，对心肌梗死有显著功效。川芎升发清气，降香降泄浊气，一升一降，使清旷之区得以复原。由于虫类药猛烈有毒、其性多燥，故以麦冬滋阴润燥。石菖蒲化痰开窍，茯苓健脾渗湿，甘草调和诸药。药理方面，丹参［14］与当归［15］具有抗凝血及抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、保护心肌的作用；白僵蚕与水蛭［16，17］可活化纤溶系统、水解纤维蛋白、抑制血栓的形成；蜈蚣［18］可有效抗心肌缺血、保护心肌及血管内皮细胞；土鳖虫［19］具有抗凝、保护血管内皮的作用；川芎［20］可抑制血栓形成和血小板聚集，抗心肌缺血；降香［21］具有促进心肌梗死后大鼠血管新生作用；全方于活血化瘀药之中寓养血益阴理气之品以调整脏腑，结合针刺疗法以调整经络，二者结合则脏腑经络同治，扶正祛邪，攻补兼施，终获佳效。

钾离子通道，是心肌细胞膜上的一种重要通道，可控制心肌兴奋性，参与心肌缺血时心肌梗死、心力衰竭等病变的发生与发展［22］。根据其蛋白跨膜结构的不同，分为电压门控钾离子通道（Kv）和内向整流钾离子通道（Kir）［23］。哺乳动物心肌动作电位的振幅和持续时间在很大程度上是由Kv通道决定［24］。瞬时外向钾离子通道作为Kv通道的一种，其通道蛋白主要是由Kv4.2基因编码所构成［25］。与Kv通道相互作用的蛋白质KChIP2是KChIPs 家族在心肌细胞中唯一表达的家族成员，与Kv4.2有专一的结合特性［26］。当瞬时外向钾电流（Ito）被抑制时心肌细胞动作电位时程延长，出现心肌缺血症状，引起心肌梗死的发生［27］。Ito分为快速瞬时外向钾电流（Ito.f）和慢速瞬时外向钾电流（Ito.s）［28］。Kv4.3是Ito.f的主要成分［29］，Kv1.4是Ito.S的主要成分［30］。故Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2蛋白的表达与心肌缺血状态的改善有密不可分的关系。bFGF，为人体内最有效的促血管因子，不仅能促进血管新生与心肌细胞再生，还能促进微血管侧支与动脉性侧支的生长［31］。心肌细胞在缺血状态下能够分泌bFGF，并刺激血管内皮细胞产生胶原酶和纤溶酶原激活物，降解基底膜，进而诱导毛细血管内皮细胞形成管腔样结构，对血管新生、扩大血容量及侧枝循环建立起重要作用［32］。本实验结果显示：（1）治疗结束时，相比模型组各治疗组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2及bFGF 蛋白含量升高（P＜0.05），其中针药结合组升高最为显著（P＜0.05），说明针刺结合蹊径通脉汤具有更加明显疗效，其作用机制可能是通过调控瞬时外向钾离子通道相关蛋白、建立侧枝循环实现；（2）治疗结束30 d 后，相比模型组各治疗组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2及bFGF蛋白含量升高（P＜0.05），其中针药结合组升高最为明显（P＜0.05）），说明针刺结合蹊径通脉汤此时仍然具有疗效；（3）相比治疗结束时的各治疗组，治疗结束30 d 后的各治疗组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2及bFGF蛋白表达虽有些许回落（P＜0.05），但仍高于此时的模型组（P＜0.05），其中针药结合组回落最小（P＜0.05），说明针刺结合蹊径通脉汤具有更加持续良好的疗效，可以持续改善心肌缺血状态，有效扩大血容量。

综上所述，针刺结合蹊径通脉汤对心肌梗死大鼠具有持续良好的疗效，其作用机制可能是通过瞬时外向钾离子通道，持续上调Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 及bFGF蛋白含量实现。