西番莲果皮多糖改善肠道功能及降血糖活性

李 霞, 陈海鸥, 尚一帆, 韦 滢, 崔萌佳, 单 杨, 李海云

(1.桂林理工大学 化学与生物工程学院, 广西 桂林 541006; 2.桂林万禾农产品有限公司, 广西 桂林 541006;3.湖南省农科院农产品加工研究所, 长沙 410125)

西番莲(PassifloraedulisSims), 又称百香果、 鸡蛋果, 是西番莲科西番莲属多年生草质藤本植物的果实, 起源于热带地区[1]。西番莲果肉中含有丰富的营养物质, 果皮也含有许多活性成分, 包括多糖、 多酚、 黄酮和生物碱等[2-3], 其中多糖是构成西番莲果皮的主要功能成分, 具有降血脂、 抗氧化和抗炎等生物活性[4-5]。研究表明, 多糖能够调节肠道微生物的丰度, 且能够被肠道微生物降解[6], 促进有益于机体健康的短链脂肪酸(乙酸、 丙酸、 丁酸、 异丁酸、 戊酸和异戊酸等)生成, 调节机体的降血糖、 降血脂和免疫等功能[7]。

李霞等[1]研究发现, 西番莲果皮多糖具有一定的抗氧化活性, 且在一定浓度范围内呈量效关系; Salgado等[8]用添加西番莲果皮粉的饲料饲喂糖尿病大鼠后, 大鼠血糖降低, 肝糖原含量显著增加; Farid等[9]临床试验发现, 西番莲果皮提取物可一定程度的减少膝关节炎症, 改善膝关节炎疼痛等症状。此外, 多糖的来源广泛、 毒副作用低, 因此开发多糖为益生元、 降血糖和降血脂等保健食品具有广阔的应用前景。但关于西番莲果皮多糖改善肠道健康方面的研究鲜有报道。

本文以西番莲果皮为材料, 采用热水煮提和碱煮提法提取多糖, 研究西番莲果皮多糖对大鼠的胃肠蠕动功能、 短链脂肪酸的生成及血糖、 血脂调节的影响, 以期为西番莲果皮多糖在保健食品的开发方向提供理论数据和奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物: SD大鼠, 湖南斯莱克景达实验动物有限公司, 雄性, 体质量(230 ± 40) g; 西番莲, 桂林万禾农产品有限公司; 葡萄糖、 葡萄糖醛酸， 上海沪峰生物科技有限公司; 苯酚、 上海化学试剂有限公司; 浓硫酸， 廉江市爱廉化学试剂有限公司; 四硼酸钠、 咔唑, 西陇科学股份有限公司。

1.2 仪器

高效液相色谱仪: Agilent 1100型, 美国 Agilent 公司; 紫外检测器: G1315B型, 美国 Agilent 公司; pH计: AZ8685型, 台湾衡欣科技股份有限公司; 安准血糖仪， 三诺生物传感股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 西番莲果皮多糖的制备 水提西番莲果皮多糖: 西番莲果皮， 干燥粉碎, 75 ℃水浴浸提2 h(料液比1∶40, 浸提4次), 抽滤, 离心(4 000 r/min, 15 min), 浓缩, 冷冻干燥, 得到西番莲果皮水提多糖(water extracted polysaccharide fromPassifloraedulisSims peel, WPEP)。

碱提西番莲果皮多糖: 将水提西番莲果皮残渣用6%氢氧化钠浸没, 75 ℃ 浸提2 h、 4次, 抽滤, 离心(4 000 r/min, 15 min), 浓缩, 35%盐酸中和, 流水透析48 h, 浓缩, 冷冻干燥, 得到碱提西番莲果皮多糖(alkali extracted polysaccharide fromPassifloraedulisSims peel, APEP)。

1.3.2 西番莲果皮多糖理化性质的检测 总糖含量的测定。以葡萄糖为标准品, 制作标准曲线。参考文献[1], 略作优化, 将样品配制为1 mg/mL, 取1.0 mL样品, 加入0.5 mL 6%苯酚及2.5 mL浓硫酸, 摇匀， 冷却, 于490 nm测量光密度值, 对比标准曲线求出总糖含量。

糖醛酸含量根据文献[11]测定, 以葡萄糖醛酸为标准品, 制作标准曲线。将样品配制为1 mg/mL, 取1.0 mL多糖样品, 在冰水浴中加入6.0 mL四硼酸钠浓硫酸, 摇匀后在85 ℃水浴中静置20 min, 待冷却到室温, 加入0.2 mL咔唑试液, 置于室温环境下保持2 h, 在525 nm下测定其光密度值, 对比标准曲线求出样品中糖醛酸含量。

还原糖含量的测定。以葡萄糖为标准品, 制作标准曲线。将样品配制为1 mg/mL, 取2.0 mL, 加入2 mL DNS试剂, 摇匀后在沸水浴条件下反应5 min, 流水下迅速冷却至室温, 加蒸馏水至15.0 mL, 摇匀, 于490 nm波长下测光密度值, 对比标准曲线求出样品中还原糖含量[12]。

蛋白含量的测定。以牛血清蛋白为标准品, 绘制标准曲线。将样品配制为1 mg/mL, 取1.0 mL加入5.0 mL考马斯亮蓝, 试剂旋涡混匀, 静置5 min, 于595 nm波长下测光密度值, 对比标准曲线求出样品中蛋白含量[13]。

1.3.3 动物试验设计 (1)大鼠的分组及饲养。本次试验共用24只大鼠, 随机分为3组(8只/组):对照组(no-treatment control group, NC): 喂食基础饲料; WPEP组: 喂食混有0.2%WPEP(质量分数, 下同)的基础饲料; APEP组: 喂食混有0.2%APEP的基础饲料。饲养温度为25 ± 3 ℃, 饲养期间自然光照, 自由饮水和取食。干预饲养时间为5周, 期间记录大鼠体质量及食物摄入量。

基础饲料组分为玉米淀粉、 酪蛋白(蛋白≥85%)、 糊化玉米淀粉、 蔗糖、 大豆油、 样品、 混合矿物质、 混合维生素。其中, 混合矿物质包含: 氯化钠、 氯化镁、 氯化锂、 氟化钠、 硫酸钾、 十二水硫酸铬钾、 无水碳酸钙、 碳酸锰、 碱式碳酸锌、 碱式碳酸铜、 碳酸亚镍、 磷酸二氢钾、 碘酸钾、 钒酸铵、 硼酸、 二氧化硒、 四水钼酸铵、 九水偏硅酸钠、 柠檬酸三钾、 柠檬酸铁; 混合维生素包含: 维生素A、 维生素B1、 维生素B2、 维生素B3、 维生素B6、 维生素B9、 维生素B12、 维生素D3、 维生素E、 维生素K、 D-生物素、 泛酸钙。酪蛋白(蛋白≥85%)、 糊化玉米淀粉、 蔗糖、 大豆油、 混合矿物质、 混合维生素在对照组、 试验组含量一致, 均为14.07%、 15.56%、 11.77%、 4.0%、 2.77%、 0.03%, 玉米淀粉、 样品在对照组含量为51.80%、 0, 在试验组含量为51.60%、 0.2%。

(2)胃肠道运输时间(GITT)的测定。饲养大鼠5周后, 测定大鼠胃肠道通过时间(gastrointestinal transit time, GITT)[14]。按照活性炭∶水为1∶50的质量比在饲料里添加活性炭, 灌喂给禁食处理8 h的大鼠, 0.5 h后颈椎脱臼法处死大鼠, 打开腹腔分离肠系膜, 剪取上端自幽门、 下端至回盲部的肠管, 置于托盘上, 轻轻将小肠拉成直线进行测量, 计算公式

p=d1/d×100%，

式中:p—活性炭推进率,%;d1—活性炭推进长度, mm;d—肠管长度, mm。

(3)鼠便pH及含水率的测定[15]。饲养3周后取新鲜鼠便, 使用pH计测定pH值， 记录鼠便湿重和烘干后的质量, 计算鼠便的含水率(w)

w=(m0-m1)/m0×100%,

式中:m—鼠便湿重, g;m1—鼠便干重, g。

(4)短链脂肪酸的测定。粪便样品立即与10倍体积(0.02%磷酸)酸化pH=3.0的异丙醇溶液在离心管中混合， 静置30 min后, 4 000 r/min离心(4 ℃)5 min, 上清液保存并用无水硫酸钠脱水, 立即用0.22 μm有机膜过滤。

用单标法测定了乙酸、 丙酸、 异丁酸、 正丁酸、 异戊酸和戊酸的保留时间, 并用混合标法确定了标准线。根据各样品的曲线峰面积值和标准曲线计算各样品的浓度。高效液相色谱条件[16]为: 色谱柱Agilent 6890 N, db-ffap122-3232毛细管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm), 载气为He, 载气流速1.5 mL/min, 进样温度200 ℃, 氢火焰离子化检测器温度250 ℃, 进样量2 μL, 分流比10∶1。 升温程序: 初始温度85 ℃, 保持2 min; 以15 ℃/min升至230 ℃, 保持3 min; 尾吹气流量25 mL/min。

(5)血糖、 甘油三酯及胆固醇的测定。饲养大鼠5周后, 鼠尾取血0.5 mL, 使用血糖仪检测大鼠血糖; 采用鼠尾刺血法取血, 立即以2 500 r/min离心10 min获得血清, 并在4 ℃下保存。根据试剂盒说明检测甘油三酯(TG)和胆固醇(CHO)。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析, 组间比较采用t检验, 以评估组之间的差异,P<0.05差异显著,P<0.01差异极显著, 采用GraphPad Prism 8进行作图。

2 结果与分析

2.1 西番莲果皮多糖的理化性质分析

采用苯酚硫酸法、 硫酸咔唑法、 DNS法和托马斯亮蓝法检测西番莲果皮多糖的总糖、 糖醛酸、 还原糖和蛋白含量, 结果见表1。WPEP和APEP的总糖含量分别为13.72%和0.39%, 原因是在碱浸提的过程中糖醛酸被中和。APEP的总糖含量明显高于WPEP； 与WEPE相比, AEPE的蛋白质的含量更高, 这归因于蛋白质和色素广泛溶解在碱性溶液中, 从而导致纯化过程复杂和蛋白质含量较高[17]。

表1 西番莲果皮多糖样品的理化性质

2.2 西番莲果皮多糖对大鼠体质量及食物摄入量的影响

如图1a所示, 大鼠的体质量随着试验的进行而增加。与NC中大鼠的体质量相比, 多糖组观察到有显著性差异(P< 0.01)， 表明西番莲果皮多糖对大鼠的体质量有一定的影响。图1b中, NC中的食物摄入量为144.41 g/d, APEP组大鼠的食物摄入量达到最高, APEP和WPEP组的食物摄入量分别比NC组高7.60%和5.66%。肥胖型糖尿病症是代谢综合征的一种表现, 其特征为多食、 多饮和肥胖。可见， 体质量不是完全由食物摄入量决定的, 还取决于代谢功能[18]。可以推断, APEP对改善肠道代谢具有更大的潜在作用。

图1 西番莲果皮多糖对大鼠体质量(a)及食物摄入量(b)的影响

2.3 西番莲果皮多糖对大鼠肠道活性炭推进率的影响

肠道内活性炭的推进率可作为衡量大鼠小肠蠕动功能的指标之一[19]。由图2可知, 多糖处理组相较于对照组, 活性炭在小肠中推进率较高, 均有显著性差异(P<0.05)。肠道蠕动频率较低, 会造成粪便停留在肠道内的时间加长, 导致有害细菌的大量繁殖, 从而威胁肠道健康[20]。用西番莲果皮多糖饲养大鼠可以明显提高活性炭在小肠中的推进率, 且WPEP组的作用强于APEP组， 说明西番莲果皮多糖具有较好的促进小肠蠕动的效果, 有益于肠道健康。

图2 西番莲果皮多糖对活性炭在大鼠肠道中推进率的影响

2.4 西番莲果皮多糖对大鼠粪便含水率和pH的影响

试验期间,各组大鼠粪便大小均一,无便秘或稀便现象。多糖处理组的鼠便含水率(图3a)(66.80%±4.61%、 59.88%±3.11%)均高于对照组(52.38%±4.31%), 且差异极显著(P<0.01), 说明西番莲果皮多糖可以帮助软化粪便, 缓解便秘; 多糖处理组的鼠便pH值(7.48±0.11、 7.25±0.14)均低于对照组(7.82±0.22), 差异极显著(P<0.01), 说明西番莲果皮多糖可以降低肠道内pH。肠道内pH降低时有利于益生菌的生长[21], 因此推断西番莲果皮多糖能够改善肠道内有益菌的生长环境。

图3 西番莲果皮多糖对大鼠粪便含水率(a)和pH(b)的影响

2.5 西番莲果皮多糖对短链脂肪酸生成的影响

西番莲果皮多糖对大鼠粪便中短链脂肪酸的含量测试结果表明(表2), 与NC组相比, 多糖组的乙酸、 丙酸、 异丁酸和戊酸的含量明显升高, 且差异均显著。相比APEP组, WPEP组对短链脂肪酸生成的影响更大。短链脂肪酸主要在大肠内由厌氧微生物发酵碳水化合物(寡糖、 非淀粉多糖、 抗性淀粉等)生成, 能够影响结肠上皮细胞的转运, 促进结肠细胞和小肠细胞的代谢、 生长、 分化, 还可以降低结肠内环境的pH值, 减少有害菌的生长, 防止肠道功能紊乱[22]。结果表明, 西番莲果皮多糖能够影响大鼠肠内的短链脂肪酸的产生, 改变短链脂肪酸的构成比例， 从而改善大鼠的肠道功能。

表2 西番莲果皮多糖对大鼠粪便短链脂肪酸的影响

2.6 西番莲果皮多糖对血糖、 CHO和TG的影响

TG和CHO是代表机体血脂含量的两个重要指标, 血糖、 血脂的升高会诱发糖尿病、 冠心病和动脉粥样硬化等多种疾病[23]。由图4a可知, 多糖处理组的血糖有下降趋势, 相比对照组下降了10.53%和175%, 差异性不显著。此外,相比对照组CHO和TG, 多糖处理组呈下降趋势, 在CHO方面分别下降了5.48%和7.76%; 在TG方面下降了19.55%和18.05%。西番莲果皮多糖有降低大鼠血糖和血脂的趋势, 但差异性不显著, 推测是由于选用的是正常大鼠而非糖尿病模型鼠, 因此, 在后续工作中将选用Ⅱ型糖尿病小鼠为实验动物, 重点探究西番莲果皮多糖的降血糖作用。

图4 西番莲果皮多糖对大鼠血糖(a)、 胆固醇(b)和甘油三酯(c)的影响

3 结 论

以西番莲果皮为材料, 采用热水煮提和碱煮提法提取西番莲果皮中的多糖, 研究其对SD大鼠肠道功能、 血糖和血脂的调节作用。结果表明, 食用西番莲果皮多糖能够提高活性炭推进率、 降低大鼠粪便的pH、 增加粪便含水率、 促进短链脂肪酸的生成, 说明西番莲果皮多糖能够促进大鼠的肠道蠕动, 降低大鼠肠道内的pH, 为益生菌提供了有利的环境, 促进生成乙酸、 丙酸、 异丁酸和戊酸等对机体有益的短链脂肪酸。

西番莲果皮多糖对SD大鼠血糖、 血脂的影响研究表明, 食用西番莲果皮多糖能够一定程度降低大鼠的血糖、 甘油三酯和胆固醇, 但并不具有显著性差异, 表明西番莲果皮多糖具有潜在的降血糖和降血脂作用。在后续工作中将深入研究西番莲果皮多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖、 血脂的调节作用， 以及和肠道菌群的关系, 以期为西番莲果皮多糖的开发和应用提供理论数据。