调节性T细胞和淋巴细胞亚群在儿童免疫性血小板减少症发病中的意义

闫彦睿，王志银，李培岭，赵东菊，范 蕊，刘 豹，石太新

(1.新乡医学院第一附属医院儿科，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院第一附属医院检验科，河南 卫辉 453100)

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是一种因血小板破坏增加导致血小板计数减少的自身免疫性疾病，是儿童时期最常见的出血性疾病，临床表现主要为皮肤或黏膜出血、瘀斑或瘀点。儿童初诊ITP的病程多数呈良性、自限性，通常在诊断后12个月内自发缓解，但约20%的初诊ITP可发展为慢性ITP[1]。ITP的发病机制错综复杂，目前尚不完全明确。既往认为该病的发病机制是血小板自身抗体介导的血小板破坏，但随着研究的深入，人们发现其发病机制涉及体液免疫、细胞免疫等多方面[2]。近年来研究发现，CD4+细胞亚群中CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg) 也可能参与本病的发生、发展[3]，但目前国内外研究对Treg和淋巴细胞亚群是否参与ITP的发病机制仍有争议。本研究通过分析初诊ITP患儿外周血Treg及淋巴细胞亚群的水平，旨在探讨Treg和淋巴细胞亚群在儿童ITP发病机制中的意义，为ITP的靶向治疗提供新途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2019年4月至2020年8月新乡医学院第一附属医院收治的33例初诊ITP患儿为观察对象(ITP组)，其中男19例，女14例；年龄1.5个月～13岁，中位年龄2岁10个月。纳入标准：(1)符合我国儿童ITP诊断标准[1]；(2)年龄≤14岁；(3)初诊病历资料完整；(4)近1个月内未使用丙种球蛋白、糖皮质激素等治疗，未输注血小板等血液制品。排除标准：(1)在院外已给予治疗的患儿；(2)患有其他引起继发性血小板减少的疾病，如系统性红斑狼疮、再生障碍性贫血、白血病、骨髓增生异常综合征等；(3)复发ITP患儿。另选择同期来本院门诊体检的年龄和性别匹配的健康儿童20例作为对照组，其中男13例，女7例；年龄10个月～10岁，中位年龄3岁9个月。2组受试者性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，受试者家属签署知情同意书。

1.2 Treg和淋巴细胞亚群检测ITP组受试者于入院当日、对照组受试者于体检当日采集外周静脉血2 mL，置于乙二胺四乙酸(ethylenediaminete-traacetic acid，EDTA)抗凝管内，轻轻混匀，分别取抗凝血100 μL置于3只流式上样管，第1只上样管中加入藻红蛋白-花青素5.5(phycoerythrin-cyanine 5.5，PC5.5)标记的CD3(CD3-PC5.5)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的CD4(CD4-PE)、电子耦合染料(electron coupled dye，ECD)标记的CD8(CD8-ECD)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothio-cyanate，FITC)标记的CD45(CD4-FITC)、ECD标记的CD19(CD19-ECD)各20 μL，第2只上样管中加入CD4-FITC/CD3-PE/CD25-ECD/CD127-PC5各20 μL，第3只上样管中加入同型对照品 20 μL，混匀后室温避光孵育 20 min，加入500 μL溶血素，再次混匀，室温避光10 min，加入2 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)，混匀后1 100 r·min-1离心5 min，弃上清，加入500 μL PBS，混匀，使用DxFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)检测Treg和淋巴细胞亚群CD4+细胞、CD8+细胞、CD19+B细胞，计算出百分率。鼠抗人单克隆抗体CD3-PC5.5、CD3-PE、CD4-FITC、CD4-PE、CD8-ECD、CD45-FITC、CD19-ECD、CD25-ECD、CD127-PC5、同型对照品、溶血素、PBS均购自美国贝克曼库尔特有限公司。另采集受试者外周静脉血4 mL，置于2个EDTA抗凝管内，使用XN-2000型全自动血细胞分析仪(希森美康医用电子有限公司)检测血小板计数，应用固相凝集法检测血小板抗体，检测试剂盒为长春博德生物技术有限公司产品，按照说明书步骤进行操作。

2 结果

2.1 2组受试者外周血Treg水平及血小板计数比较ITP组与对照组受试者外周血Treg水平分别为(6.78±1.57)%、(8.36±1.20)%，血小板计数分别为(16.45±15.49)×109L-1、(239.30±56.74)×109L-1。ITP组受试者外周血Treg水平及血小板计数显著低于对照组，差异均有统计学意义(t=-3.848、-17.182，P<0.05)。

2.2 2组受试者外周血淋巴细胞亚群水平比较结果见表1。ITP组受试者CD4+细胞百分比、CD4+/CD8+显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；ITP组受试者CD8+细胞百分比显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。ITP组与对照组受试者CD19+B细胞百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组受试者外周血淋巴细胞亚群水平比较

2.3 ITP组受试者外周血Treg与血小板计数的相关性Pearson相关分析显示，ITP组受试者外周血Treg水平与血小板计数无显著相关性(r=-0.152，P>0.05)，见图1。

图1 ITP组受试者外周血Treg与血小板计数的相关性

2.4 外周血血小板抗体阳性与阴性ITP患儿Treg、CD4+细胞水平比较33例ITP组患儿中，血小板抗体阳性14例，血小板抗体阴性19例，血小板抗体阳性率为42.4%(14/33)。血小板抗体阳性和血小板抗体阴性ITP患儿外周血Treg水平分别为(7.14±1.95)%、(6.52±1.21)%，血小板抗体阳性与血小板抗体阴性ITP患儿外周血Treg水平比较差异无统计学意义(t=1.050，P>0.05)；血小板抗体阳性和血小板抗体阴性ITP患儿外周血CD4+细胞水平分别为(31.82±8.35)%、(34.98±7.11)%，血小板抗体阳性与血小板抗体阴性ITP患儿外周血CD4+细胞水平比较差异无统计学意义(t=-1.173，P>0.05)。

3 讨论

ITP是儿童血小板减少的常见原因之一，但其发病机制目前仍不清楚。长期以来，自身抗体介导的血小板破坏被认为是ITP最为经典的发病机制，其中B淋巴细胞产生以免疫球蛋白G(immunoglo-bulin G,IgG)为主的血小板抗体参与本病的发生[4]。但是，在多达50%的患者中未检测到血小板抗体[5]；本研究中ITP患儿血小板抗体阳性率为42.4%，提示有其他机制参与ITP发病的可能。血小板抗体主要由CD19+B细胞增殖分化产生，FANG等[6]研究发现，ITP患者CD19+B细胞高于对照组，但也有研究发现ITP组与对照组CD19+B细胞无差异[7]。本研究结果显示，ITP组与对照组受试者CD19+B细胞百分比比较差异无统计学意义，也提示除血小板抗体外还有其他机制参与血小板破坏。随着对ITP发病机制研究的深入，越来越多的研究发现，ITP患者T淋巴细胞亚群及CD4+细胞亚群Treg水平异常[8-9]，表明细胞免疫异常参与本病的发生、发展。本研究结果显示，ITP患儿外周血T淋巴细胞亚群、Treg水平异常，进一步证实ITP患儿体内存在细胞免疫失衡。

T淋巴细胞主要分为CD4+细胞、CD8+细胞2个亚群，正常情况下，人体内CD4+细胞和CD8+细胞基本处于稳定、平衡的状态。国内外有多个研究发现，ITP患者CD4+细胞水平降低，CD8+细胞水平升高，CD4+/CD8+比值降低[9-10]，本研究结果显示，ITP组受试者CD4+细胞百分比、CD4+/CD8+比值均低于对照组，CD8+细胞百分比高于对照组，与上述报道一致，表明ITP患者体内存在T淋巴细胞亚群平衡紊乱，也进一步说明了细胞免疫异常可能参与了ITP的发病。CD4+细胞降低可促进自身反应性B细胞的增殖，进而产生血小板抗体，破坏血小板，推测这可能是CD4+细胞参与ITP发病机制的途径之一。研究表明，在ITP患者中存在辅助性T细胞(helper T cell，Th)1偏倚[11]，Th1促进CD8+细胞应答和IgG的产生，这可能是ITP患者CD8+细胞增高的原因。既往已有学者提出细胞毒性T淋巴细胞是ITP血小板破坏机制中的一种[12]。QIU等[13]也指出，CD8+细胞通过诱导血小板去唾液酸化导致血小板在肝脏被破坏，推测此为ITP新的发病机制之一。目前对于ITP患者体内CD8+细胞水平仍有争议，TALAAT等[14]研究显示，ITP组CD8+细胞水平与对照组比较差异无统计学意义，故需进一步研究CD8+细胞在ITP中的作用。本研究结果显示，ITP组患儿CD4+/CD8+比值低于对照组受试者，同样提示ITP患者体内可能存在细胞免疫功能紊乱。但CD4+及CD8+细胞包含许多不同的细胞亚群，CD4+细胞包括Th和Treg，CD8+细胞包括抑制性T细胞和细胞毒性T细胞，仅依靠CD4+/CD8+比值尚不能完全反映ITP患者的免疫状态。

Treg是一类具有独特免疫抑制功能的CD4+细胞，是CD4+细胞的一个特化亚群，在维持免疫耐受和体内平衡方面起着主导作用，对于预防致命性自身免疫必不可少[15]。本研究结果显示，与对照组相比，ITP组Treg水平显著降低，这与其他学者研究结果一致[16]，进一步证实了ITP患者存在外周血Treg水平降低。Treg水平下降可能打破了机体的免疫平衡，导致机体免疫抑制功能减弱，T细胞异常激活，从而导致ITP的发病。但也有研究发现，ITP患者Treg水平与健康受试者比较差异无统计学意义[17]。目前，国内外研究对此尚无定论，因此还需进一步研究Treg在ITP中的作用。目前对于Treg与血小板计数的相关性也有争议，有学者研究发现Treg与血小板计数之间存在显著正相关[18]，而韩磊等[19]认为Treg与血小板计数无相关性；本研究结果显示，Treg与血小板计数之间无显著相关性，这也提示了ITP发病机制的复杂性，需要进一步研究。

在ITP患者血小板抗体与CD4+细胞之间的关系目前尚不清楚。HU等[20]报道，在血小板抗体阳性ITP患者中存在CD4+细胞亚群失衡。在本研究中，虽然从数值上看血小板抗体阴性ITP患者的CD4+细胞百分比略高于血小板抗体阳性ITP患者，而血小板抗体阳性ITP患者的Treg水平略高于血小板抗体阴性ITP患者，但差异均无统计学意义。因为血小板抗体的产生涉及抗原递呈细胞、T细胞、B细胞和血小板自身抗原等多方面，因此CD4+细胞在ITP体液免疫紊乱中的作用仍需进一步研究。

综上所述，ITP患者外周血Treg水平、CD4+细胞百分比和CD4+/CD8+比值降低，CD8+细胞百分比升高，提示本病的发病机制涉及细胞免疫失衡。但由于本研究样本数量有限，关于Treg及淋巴细胞亚群在ITP发病机制中的意义有待进一步研究。而且最近一些研究也发现了许多新的机制如细胞因子异常、非依赖FcγR介导的血小板清除途径、遗传因素miRNA的异常、程序性死亡受体1、金属蛋白酶10等[21-22]可能参与本病的发生发展，均说明了ITP发病机制的错综复杂，需要进一步探讨。