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非瑟酮对肝脏缺血再灌注损伤小鼠肝细胞凋亡的影响

2021-03-24李泽信张永强狄文玉王建国

新乡医学院学报 2021年2期
关键词:存活率肝细胞氧化应激

李泽信,王 霄,王 迎,张永强,狄文玉,王建国

(1.新乡医学院第一附属医院肝胆胰外科,河南 卫辉 453100;2.新乡医学院药学院,河南 新乡 453003;3.新乡医学院第一附属医院麻醉科,河南 卫辉 453100;4.新乡医学院第一附属医院病理科,河南 卫辉 453100)

肝脏手术和肝移植术后常常伴随肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI),肝细胞凋亡是HIRI的主要途径和机制,也是导致术后肝功能障碍的重要因素[1]。因此,预防与治疗缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)所致的肝细胞凋亡成为当前研究的热点[2]。非瑟酮(fisetin)具有抗氧化、抗肿瘤和改善认知功能等作用[3-5],最近有研究证明,非瑟酮对心肌IRI具有剂量依赖性的保护作用[6]。但非瑟酮对HIRI的保护作用及其作用机制研究鲜有报道。本研究利用小鼠HIRI模型和小鼠正常肝细胞系(alpha mouse liver 12,AML-12)缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,HR)模型,探讨非瑟酮对HIRI小鼠肝细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组6~8周龄雄性C57BL/6小鼠18只,体质量20~25 g,由河南省实验动物中心提供。给予小鼠适应性喂养,12 h白昼、12 h黑夜交替,温度(25.0±1.0)℃,相对湿度45%~55%,自由进食水。将18只小鼠随机分为假手术(sham operation,SO)组、HIRI组和HIRI+fisetin组,每组6只。

1.2 细胞、试剂与仪器小鼠正常肝细胞系AML-12和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium/nutrient mixture F-12,DMEM/F12)购自上海中乔新舟生物科技有限公司,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、小鼠一抗β-actin和非瑟酮均购自美国Sigma公司,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)购自江苏凯基生物技术股份有限公司,丙氨酸转氨酶(alanine transarninase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所,放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipation assay,RIPA)蛋白裂解液、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)流式细胞凋亡检测试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购自瑞士Roche公司,抗荧光淬灭剂购自上海Solarbio公司,兔抗鼠一抗血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)购自美国Santa Cruz公司,羊抗兔辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G(horseradish peroxidase-labeled immunoglobulin G,IgG-HRP)和羊抗小鼠IgG-HRP均购自美国CST公司;Gel-Pro-Analyzer凝胶图像分析系统购自美国Media Cybernetics公司,Galaxy 48R三气培养箱购自德国Eppendorf公司,Varioskan LUX多功能酶标仪、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)购自美国Thermofisher公司,荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠HIRI模型制备HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠建立HIRI模型,SO组小鼠仅进行开腹和肝门游离手术。模型制备方法[7]:将小鼠以40 g·L-1水合氯醛腹腔注射(0.1 mL·10 g-1)麻醉后仰卧位固定于37 ℃恒温小动物加热垫,常规消毒后上腹部正中切口,逐层打开腹壁进入腹腔,充分暴露肝区,分离肝左叶和肝中叶的门静脉及肝动脉,并用血管夹夹闭以阻断血流,使70%的肝脏缺血,当缺血肝组织颜色变浅时即肝血管阻断成功;使用血管夹夹闭腹腔,将小鼠置于37 ℃孵育箱内;血流阻断1 h后打开腹腔,并松开血管夹使肝脏进行再灌注,然后逐层缝合关闭腹腔。缺血前1 h,HIRI+fisetin组小鼠经腹腔注射非瑟酮50 mg·kg-1,SO组和HIRI组小鼠经腹腔注射等量的DMSO。

1.3.2 标本采集再灌注6 h后再次麻醉小鼠,获取下腔静脉血及肝脏。静脉血以3 000 r·min-1离心15 min,分离上层血清,置于-80 ℃冰箱中保存待测。取部分肝组织,体积分数10%甲醛溶液固定后制备石蜡切片;另取部分肝组织迅速放入液氮中,置于-80 ℃冰箱保存,用于提取蛋白。

1.3.3 小鼠肝功能检测采用酶联免疫吸附试验检测SO组、HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠血清中ALT、AST水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 TUNEL法检测小鼠肝细胞凋亡肝组织石蜡切片常规脱蜡、水化,按照TUNEL凋亡检测试剂盒操作说明书处理切片,每张切片首先滴加蛋白酶K 100 μL并在37 ℃湿盒中渗透10 min;PBS漂洗 2次,每次5 min;滴加TUNEL反应液后置于 37 ℃湿盒中避光孵育1 h,磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)漂洗后再用含50 g·L-1胎牛血清白蛋白和体积分数0.1% Triton X-100的PBS混合液于室温下封闭15 min,滴加4′,6二脒基-2-苯吲哚盐酸溶液进行复染,然后抗荧光淬灭剂封片,荧光显微镜下拍照并保存图像,400倍视野下每张切片随机选取5个视野,应用Image J图像分析软件分别计数细胞总数和阳性细胞数(细胞核为绿色)。细胞凋亡率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.3.5 Western blot法检测小鼠肝组织中HO-1蛋白表达取液氮中保存的肝组织,RIPA裂解液裂解后提取总蛋白,应用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白量。采用5×loading buffer和PBS稀释蛋白样品,在沸水浴中煮沸5 min,制成上样液,冷却后上样,经过电泳、转膜、封闭后,将PVDF膜与溶于封闭液的兔抗鼠一抗HO-1(11 000)和小鼠一抗β-actin(12 000)在4 ℃环境下孵育过夜,含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tris buffered saline with Tween 20,TBST)洗涤3次,根据PVDF膜上目的蛋白的位置裁膜后分别加入相应的二抗:羊抗兔IgG-HRP(110 000)和羊抗小鼠IgG-HRP(110 000),室温孵育1 h,加电化学发光液后曝光,以β-actin作为内参,应用凝胶图像分析系统分析目的蛋白条带的灰度值,以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3.6 小鼠AML-12细胞HR模型制备复苏后的AML-12细胞培养于DMEM/F12完全培养基中,并置于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养24 h,细胞传代3次,待细胞生长至密度为90%左右时正处于对数生长期,将对数生长期细胞分为对照组、HR组和HR+fisetin组,分别接种于6孔板,每组接种3个孔,每孔1×105个细胞,细胞过夜培养后进行处理。对照组AML-12细胞置于37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中继续培养。HR组AML-12细胞在37 ℃下培养于DMEM/F12完全培养基中,并置于Galaxy 48R三气培养箱(含体积分数1% O2、94% N2和5% CO2)中进行缺氧处理 1 h,再将细胞置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中进行复氧培养12 h[8]。HR+fisetin组AML-12细胞在HR处理前 1 h每孔加入11.45 μg非瑟酮(终浓度为20 μmol·L-1)进行预处理。

1.3.7 CCK-8法检测AML-12细胞存活率收集3组AML-12细胞接种于96孔板中,每孔3×103个细胞,每组设5个复孔;每孔加入10 μL CCK-8,将细胞置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中继续培养2 h;在Varioskan LUX多功能酶标仪上测定波长450 nm处的吸光度值,计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。实验重复3次,取均值。

1.3.8 流式细胞术检测AML-12细胞凋亡收集3组AML-12细胞,1 000×g离心5 min,弃上清,加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC混匀,再加入10 μL碘化丙啶,混匀;室温避光孵育10~20 min,采用流式细胞术检测AML-12细胞凋亡;实验重复3次,取均值。

2 结果

2.1 3组小鼠肝功能比较结果见表1。肝脏缺血再灌注6 h后,HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠血清ALT、AST水平显著高于SO组,HIRI+fisetin组小鼠血清ALT、AST水平显著低于HIRI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组小鼠血清ALT和AST水平比较

2.2 3组小鼠肝细胞凋亡率比较结果见图1。肝脏缺血再灌注6 h后,SO组、HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠肝细胞凋亡率分别为(4.10±0.14)%、(31.29±1.01)%和(14.41±0.91)%;HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠肝细胞凋亡率显著高于SO组,HIRI+fisetin组小鼠肝细胞凋亡率显著低于HIRI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

A:SO组;B:HIRI组;C:HIRI+fisetin组。

2.3 3组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量比较结果见图2。肝脏缺血再灌注6 h后,SO组、HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量分别为1.03±0.16、1.77±0.25、3.24±0.72;HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量显著高于SO组,HIRI+fisetin组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量显著高于HIRI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

1:SO组;2:HIRI组;3:HIRI+fisetin组。

2.4 3组AML-12细胞存活率比较对照组、HR组和HR+fisetin组AML-12细胞存活率分别为(98.73±1.56)%、(42.73±3.94)%、(86.43±5.17)%;HR组AML-12细胞存活率显著低于对照组,HR+fisetin组AML-12细胞存活率显著高于HR组,差异均有统计学意义(P<0.05);HR+fisetin组与对照组AML-12细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 3组AML-12细胞凋亡率比较结果见图3。对照组、HR组和HR+fisetin组AML-12细胞凋亡率分别为(6.83±0.21)%、(24.44±0.63)%、(7.63±0.52)%;HR组AML-12细胞凋亡率显著高于对照组,HR+fisetin组AML-12细胞凋亡率显著低于HR组,差异均有统计学意义(P<0.05);HR+fisetin组与对照组AML-12细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A:对照组;B:HR组;C:HR+fisetin组。

3 讨论

HIRI是肝移植手术、肝脏切除手术和出血性休克的主要并发症[9],探索安全、有效的HIRI治疗药物是非常必要的。非瑟酮为3,3′4′7-四羟基黄酮,有研究显示,非瑟酮不但有抗炎作用,而且能够对抗氧化应激、清除氧自由基[10]。本研究应用小鼠HIRI模型,观察在机体内非瑟酮对HIRI的保护作用,结果显示,肝脏缺血再灌注6 h后,HIRI组小鼠血清ALT、AST水平显著高于SO组,HIRI+fisetin组小鼠血清ALT、AST水平显著低于HIRI组;提示非瑟酮对HIRI小鼠肝功能具有保护作用。IRI损伤的发病机制比较复杂,可能与线粒体功能障碍、炎症、氧化应激所致的细胞凋亡密切相关[11]。细胞凋亡主要通过内质网应激途径、线粒体途径和死亡受体途径等3大途径介导。本研究结果显示,HIRI组小鼠肝细胞凋亡率显著高于SO组,HIRI+fisetin组小鼠肝细胞凋亡率显著低于HIRI组;提示非瑟酮可能通过抑制肝细胞凋亡而改善HIRI。

氧自由基的产生及氧化应激的过度发生会激活内质网应激凋亡途径中相关的凋亡蛋白,启动基因控制的细胞程序性死亡,而非瑟酮可通过抗氧化应激和抗炎作用来改善心肌细胞凋亡性损伤[12-13]。由此推测,非瑟酮对HIRI的保护作用也可能是通过非瑟酮的抗氧化作用抑制肝细胞凋亡而实现。HO-1可把血红蛋白降解为二价铁离子、一氧化碳和胆绿素,这些降解产物通过抑制氧自由基的释放而起到抗氧化作用,进而发挥抑制细胞凋亡效应[14-15]。有研究显示,HO-1可通过对抗氧化应激来调节肝细胞凋亡的内源性途径,从而对HIRI起到保护作用[16]。姜黄素、槲皮素被证明是HO-1表达的强效诱导剂,能诱导肝细胞高表达HO-1,抵御肝脏氧化应激性损伤[17-18]。同为类黄酮药物的非瑟酮是否具有诱导肝组织HO-1表达的作用鲜有报道。本研究结果显示,HIRI组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量显著高于SO组,HIRI+fisetin组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量显著高于HIRI组;提示非瑟酮可能通过诱导HO-1高表达来对抗氧化应激反应,阻断肝细胞凋亡的内源性途径,从而抑制HIRI小鼠肝细胞凋亡。

为进一步验证非瑟酮对缺血再灌注诱导的肝细胞凋亡具有保护作用,本研究采用小鼠AML-12细胞HR模型进行体外实验,结果显示,HR组AML-12细胞存活率显著低于对照组,HR+fisetin组AML-12细胞存活率显著高于HR组;HR组AML-12细胞凋亡率显著高于对照组,HR+fisetin组AML-12细胞凋亡率显著低于HR组;提示非瑟酮可能通过抑制肝细胞凋亡来发挥对HIRI的保护作用。

综上所述,非瑟酮对HIRI具有保护作用,其机制可能与非瑟酮诱导HO-1高表达、对抗氧化应激、抑制肝细胞凋亡有关。本研究为深入探讨HO-1调控肝细胞凋亡的信号通路提供了理论基础。

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