鸭坦布苏病毒冻干高免卵黄抗体的研制

王红琳 卢 琴 罗青平 张蓉蓉 温国元 商 雨 邵华斌

湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，武汉430064

鸭坦布苏病毒病是由黄病毒科、黄病毒属的坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）引起的以产蛋鸭产蛋量骤降和雏鸭或育成鸭出现神经症状为主要特征的一种新型急性传染病，又称为鸭出血性卵巢炎、鸭黄病毒病。以种鸭、蛋鸭产蛋量急剧下降，产蛋率从产蛋高峰90%左右下降至10%不等；雏鸭发生神经系统症状甚至死亡为主要特征[1-2]。自2010年暴发以来，该病在我国大陆地区广泛传播，给国内的家禽养殖业造成了严重的经济损失。该病传播迅速，蔓延范围广，给养鸭业造成了严重的经济损失[3-4]。卵黄抗体（IgY）是预防和紧急治疗该病的有效防制剂[5]，由于常规卵黄抗体一般为液体，质量不稳定、副作用大、体积大运输不便。因此，本试验通过用鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫SPF 蛋鸡后，收集卵黄进行IgY的提纯和冻干研究，旨在克服常规卵黄抗体的缺陷，达到有效预防和治疗该病的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）毒种：鸭坦布苏病毒（DTMUV）JL2011 株，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室分离、保存。

2）鸭坦布苏病毒病灭活苗：由本实验室制备，将DTMUV JL2011 株接种SPF 鸡胚，按常规方法[6]制备成油乳剂灭活苗，每毫升疫苗至少含灭活前的鸭坦布苏病毒106.0 EID50，质量检验合格，备用。

3）SPF 鸡胚：由北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司提供的SPF 种蛋，在实验室孵育至9日龄，备用。

4）SPF 蛋鸡：由北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司提供的SPF 种蛋，在实验室孵育至所需日龄，隔离饲养备用。

5）雏鸭：由湖北宜城某养殖场提供种蛋，在实验室孵育至7日龄，且鸭坦布苏病毒抗体为阴性者用于试验。

1.2 试验方法

1）蛋鸡的免疫及高免鸡蛋的收集。用DTMUV灭活苗免疫接种90日龄SPF 蛋鸡50 只。首免，每只鸡肌肉注射灭活苗1.5 mL；间隔14 d 后进行第2 次免疫，每只鸡2.0 mL；二免后间隔14 d 进行第3 次加强免疫，每只鸡2.0 mL。第3 次加强免疫后第14 天开始收集鸡蛋。做好记录和标记，置于4~8 ℃储存备用。

2）卵黄抗体（IgY）的提取。将收集的鸡蛋用清水冲洗干净后，浸入水温42 ℃的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒15~20 min，随后将鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒30 min。采取手工打蛋，充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄于一洁净容器内，充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，然后加入等体积经65 ℃30 min消毒并冷却的蒸馏水，搅拌混匀后，60~65 ℃加热灭活8~15 min。先加入相当于原卵黄体积4 倍，用盐酸调pH 为4.2 的蒸馏水，将水温降至1~4 ℃，加入灭活的蛋黄液，边加边搅拌，之后4~8 ℃保温静置4 h，离心分离上清液；加入辛酸至终浓度为0.02%，搅拌混匀，室温静置2~4 h。用尼龙滤布粗滤，再用超滤膜过滤浓缩，备用，取样待检。

3）鸡胚中和试验。用灭菌生理盐水将萃提的IgY 做10、102、103、104、105、106倍稀释，分别与100倍ELD50的鸭坦布苏病毒等比混合，37 ℃作用1 h，接种10日龄SPF 鸡胚，0.2 mL/枚，各5 枚，同时设病毒对照组和102倍稀释的未免疫的SPF 鸡蛋卵黄对照组，7 d 内观察鸡胚死亡情况，用Reed-Muench法计算卵黄抗体中和效价。

4）冻干。取萃提后无菌检验合格的IgY 溶液加入脱脂牛奶、蔗糖等作为稳定剂，充分摇匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥（按《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版附录进行）。

5）IgY 冻干前后的效价检测。随机抽取冻干前后各3 瓶样品，采用间接ELISA 方法[7]检测其效价，同时设非免疫鸡蛋的卵黄作为对照。

6）攻毒保护试验。将20 只健康7日龄雏鸭随机分成2 组，IgY 免疫组10 只，对照组10 只，免疫组每只雏鸭皮下接种制备的冻干卵黄抗体0.5 mL，24 h 后免疫组和对照组均肌肉注射DTMUV 强毒株，隔离饲养，观察14 d。

2 结果与分析

2.1 鸡胚中和试验

将第2 次免疫后2 周到第3 次免疫后8 周收集的鸡蛋分为9 组，分别取样进行鸡胚中和试验。结果标明，第3 次免疫后2 周IgY 溶液的鸡胚中和效价达到1∶103.5，与邹晓娟[8]研究结果高度一致；三免后4 周、5 周达到最高（1∶104.5），有效中和效价一直持续到三免后7 周，8 周下降至1∶103.0（图1）。

图1 DTMUV 灭活苗免疫蛋鸡后IgY 抗体消长规律

2.2 IgY 冻干前后的效价检测

间接ELISA 方法检测结果如图2，冻干前（免疫组1~3）、冻干后（冻干卵黄组1~3）的特异性明显高于非免疫组，判定标准为S/N≥2.1 为阳性。说明IgY冻干前、后效价保持一致，冻干对效价没有影响。

图2 鸭坦布苏病毒卵黄抗体冻干前后的效价检测结果

2.3 攻毒保护试验

IgY 免疫组10 只鸭免疫卵黄抗体24 h 后，肌肉注射DTMU 毒株后第3 天有2 只鸭出现减食、精神萎靡、腹泻等症状，持续2~3 d 后逐渐恢复正常，未出现死亡，保护率达100%，观察14 d 后对鸭进行剖检，均无肉眼可见的病理变化；对照组的10 只雏鸭在攻毒后3 d 开始出现减食、精神萎靡、腹泻等症状，并有部分鸭出现转圈、运动失调等神经症状，随后陆续死亡8 只，死亡鸭剖检均可见肝脏肿大、淤血、坏死、脾脏肿大、心肌岀血等病理变化，观察14 d 后，剖检发病未死亡的2 只鸭，可见肝脏、脾脏肿大等病理变化，保护率20%（表1）。

表1 冻干卵黄抗体的攻毒保护试验结果

3 讨 论

1）本研究用鸭坦布苏病毒病灭活苗三次免疫产蛋鸡，收取高免鸡蛋，将萃提的IgY 溶液制成冻干制剂后，其效价没有发生改变，克服了常规水剂卵黄抗体的缺陷，具有质量稳定、副作用小、无残留、易于保存、运输方便等优点，为鸭坦布苏病毒的防控提供了一种有效的冻干高免卵黄抗体制剂。

2）间接ELISA 方法是血清学中较常用的检测方法之一，具有特异性强、灵敏度高及检测速度快等特点，目前广泛应用于动物的疾病诊断及疫苗效果的评价方面，本试验证明也可用于卵黄抗体的免疫效价评价，与施少华等[7]研究结果相吻合。

3）本研究制备的冻干卵黄抗体对7日龄雏鸭的免疫攻毒保护试验结果表明，未免疫卵黄抗体健康雏鸭的发病率达100%，死亡率达80%；而卵黄抗体免疫组的死亡率为0%，保护率达100%，说明卵黄抗体能够有效保护鸭坦布苏病毒强毒的攻击。冻干卵黄抗体对产蛋鸭的免疫攻毒保护试验及临床应用效果有待于下一步研究。

4）鸭坦布苏病毒病一年四季均可发生，在防控中使用高免卵黄抗体时应注意以下几点：①早发现、早诊断、早治疗；②疫苗免疫失败后可用高免卵黄抗体紧急预防接种加以控制，减少死亡；③注射高免卵黄抗体时为防止局部感染，可同时投喂2~3 d的广谱抗生素效果更好。