小细胞肺癌可视化PDOX肿瘤动物模型免疫表型Ki-67表达的研究进展

吴柳盛 李小强

【摘要】 小细胞肺癌（SCLC）是肺癌所有病理类型中预后最差的一种，患者生存周期极短，死亡率极高。虽然SCLC对化疗药物敏感，临床上抗肿瘤药物治疗成为主流，但有循证医学研究发现在临床中不同的患癌个体之间对抗肿瘤药物的敏感性和耐受性存在着差异，这给临床治疗带来了困难和挑战。因此，人们急需要一种能高度模拟体内肿瘤细胞生长微环境，能与患者进行同步化动态观察抗肿瘤药物应答的理想动物模型。可视化PDOX肿瘤动物模型满足了这些需求，这也是目前国际上最前沿的肿瘤动物模型构建技术，避免了个体差异，为临床治疗提供了个性化思路，同时Ki-67免疫表型表达的监测为早期SCLC的诊断提供了有效帮助。现对最近国内外SCLC可视化PDOX肿瘤动物模型构建技术和免疫表型Ki-67表达监测的研究进展以及该模型对临床上不同个体之间抗肿瘤药物应答差异做全面综述。

【关键词】 小细胞肺癌 可视化PDOX肿瘤动物模型 Ki-67

[Abstract] Small cell lung cancer （SCLC） has the worst prognosis among all pathological types of lung cancer. The survival cycle of patients is very short and the mortality rate is very high. Although SCLC is sensitive to chemotherapy drugs and anti-tumor drug therapy has become the mainstream in clinical practice， evidence-based medicine studies have found that there are differences in the sensitivity and tolerance of anti-tumor drugs among different cancer patients in clinical practice， which brings difficulties and challenges to clinical treatment. Therefore， there is an urgent need for an ideal animal model that can highly simulate the microenvironment of tumor cell growth in vivo and can dynamically observe the response to antitumor drugs in synchronization with patients. Visualized PDOX tumor animal model meets these needs， which is also the most advanced tumor animal model construction technology in the world at present. It avoids individual differences and provides personalized ideas for clinical treatment. Meanwhile， the monitoring of Ki-67 immunophenotype expression provides effective help for the diagnosis of early SCLC. In this paper， the research progress of visualized PDOX tumor animal model construction technology and immunophenotype Ki-67 expression monitoring of SCLC at home and abroad， as well as the clinical differences of anti-tumor drug response among different individuals in this model are comprehensively reviewed.

[Key words] SCLC Visualized PDOX tumor animal model Ki-67

First-author’s address： Peking University Shenzhen Hospital， Shenzhen 518036， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.25.042

小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）占全部肺癌的15%～17%[1]，病情恶化快，可迅速出现远处内脏肿瘤转移，生存寿命短，死亡率极高，同时在临床上不同肿瘤患者个体之间存在着抗肿瘤药物的耐受差异，给临床治疗与疗效评估带来了困难。目前，小细胞肺癌发病率居高不下，而临床治疗效果不明确，所以可视化PDOX小细胞肺癌动物模型的构建对于其病因学研究和临床抗肿瘤药物耐受机制研究显得相关重要。实验对象多为免疫缺陷小鼠（裸鼠）典型代表，普通小鼠具有NK细胞和T淋巴细胞等存在免疫排斥，移植效果差。目前可通过绿色荧光蛋白（GFP）的肿瘤在小鼠体内动态生长的无创成像技术[2]。这种方法既能够更加准确地复制患者肿瘤的发生发展，生物学行为和抗肿瘤治疗药物应答，也能够有效避免动物伦理学问题，促进了临床上小细胞肺癌患者个性化和精准化抗癌治疗，提升治疗效果，降低毒副作用和治疗费用，并且小细胞肺癌病情发展迅速，如果没有进行早期诊断和及时化疗，患者会因为小细胞肺癌的远处转移迅速死亡[3]。因此，在临床中探索无创普遍简便迅速的检查来确诊早期SCLC具有十分重要的意义。本文探讨Ki-67与SCLC临床特征关系，免疫组化染色以细胞质或细胞核出现背景清晰的黄色或棕黄色颗粒为阳性表达，其中Ki-67着色部位在细胞核，免疫组化是确诊SCLC的重要方法之一。在检索诸多文献资料中发现3/4的SCLC患者Ki-67指数≥60%，因此，筆者猜测Ki-67≥60%对于临床分期及评估预后具有一定的指导意义。

1 体内外肿瘤模型的发展演变历程（从肿瘤细胞2D培养模型到可视化PDOX肿瘤动物模型的跨越）

PDOX肿瘤动物模型构建技术还很年轻，是最近几年才发展起来的一门新技术。早在1986年Freeman等[4]研究证明了肿瘤组织在体外培养条件下，可以长期存活并维持类似体内的肿瘤微环境，奠定了PDOX模型构建的基础，使得培养的肿瘤成了实际癌症患者的代表，支持肿瘤生物学的基础研究以及临床相关药物测试。随着技术的不断完善和发展，PDOX肿瘤动物模型构建正在不断向临床诊疗方向靠拢。Higuchi等[5]成功构建体外PDOX模型与临床肿瘤患者进行同步化观察，这两者的结合促进了对因肿瘤异质性和肿瘤微环境异质性而导致抗肿瘤药物耐受性个体差异及效果不确定性的机制研究。对于了解体内外肿瘤动物模型构建的发展历程有利于新技术的研发和完善。

1.1 体外肿瘤细胞2D培养 文献[6-7]报道了一个可量化的3D肺癌模型，并通过全基因组CRISPR筛选发现2D肺癌细胞培养与3D肺癌模型之间存在的基因差异，尤其是突变基因的差异巨大。体外肿瘤细胞2D培养方法：通过组织消化获取肿瘤细胞（原代细胞），然后进行体外传代扩增（2D）和体外给药观察，最后再利用ATP-TCA检测获取结果。

1.2 体外肿瘤细胞3D培养 Rodrigues等[8]利用肿瘤细胞体外立体三维结构进行传代培养，虽说开发了一个可量化的3D原发恶性肿瘤球状模型，但仍然不能形成与体内类似的三维空间结构。体外肿瘤细胞3D培养方法：同样通过组织消化获取肿瘤细胞（原代细胞），然后再进行基质胶进行包埋和3D支架诱导扩增培养，最后在利用ATP-TCA检测获取结果。

1.3 体内肿瘤细胞包埋培养 张晓斌等[9]利用沉渣包埋技术来进行体内肿瘤细胞的培养，这种培养技术在很早就应用实施了，该种建模成本比较低，同时操作简便，但缺点就是无法贴近临床上肿瘤患者的真实情况。体内肿瘤细胞包埋培养方法：组织消化获取原代肿瘤细胞，然后用专门的装置将肿瘤细胞埋入小鼠体内，最后再利用ATP-TCA檢测获取结果。

1.4 类器官培养 北京协和医院的周鲁林[10]提出建立一种循环肿瘤干细胞的3D类器官培养技术，以及基于微流控液滴的单细胞分离和标记技术，通过上述同样的方法进行3D类器官培养，成功培养获得肺癌的肿瘤细胞微球。类器官培养方法：组织消化获取肿瘤细胞（干性细胞），然后体外细胞因子调控培养来构建类器官，最后再利用ATP-TCA检测获取结果。

1.5 活组织体外培养（3D-histoculture drug response assay ，3D-HDRA） 将手术切除或活检获取的活性肿瘤组织块，经体外培养后，进行抗肿瘤药物试验的独特体内外肿瘤活组织器官模型。3D-HDRA维持了肿瘤组织体外的三维立体生长方式，能够更精准地模拟肿瘤细胞生长微环境，对于研究肿瘤之间信息传导以及新的靶向药物研发具有更多的优势[11-13]。

1.6 异种移植物（PDX）体内肿瘤细胞培养 SCLC患者来源的PDX可以通过活检或循环肿瘤细胞（CTC）产生。Drapkin等[14]利用已建立的用于组织采集的临床平移管道和用于CTC浓缩的自动化微流控平台，成功构架小细胞肺癌（SCLC）的PDX培养，证明这些模型中供体肿瘤的突变景观和功能特征。

1.7 可视化PDOX体内肿瘤细胞培养 目前肿瘤动物模型构建的最前沿的技术：可视化PDOX肿瘤模型构建，即通过对裸鼠进行肿瘤细胞的原位器官移植，无限性地模拟患者机体内肿瘤的动态环境变化[15-17]。利用绿色荧光蛋白（GFP）/荧光素酶（Luc）的活体成像技术等，可视化地观察动物模型体内肿瘤的生长情况[18-19]。该模型的构建极大地推动了临床肿瘤个性化治疗和精准治疗，特别是SCLC术后化疗中不同个体对抗肿瘤药物的耐受机制的研究。上述7种体内外肿瘤细胞培养优势和不足比较见表1。

2 SCLC可视化PDOX肿瘤动物模型的应用

随着可视化PDOX肿瘤动物模型的技术的不断完善和发展，越来越多临床上恶性肿瘤模型成功构建，这对于肿瘤患者的抗肿瘤治疗的药物筛选和疗效评估具有重大的现实意义。可视化PDOX肿瘤动物模型在乳腺癌以及前列腺癌领域较为常用，但在小细胞肺癌领域很少报道。而SCLC具有转移早，进展快的特点，这就需要在很短的时间内进行有效化疗，还需要观察患者对某一种化疗药物疗效如何以及其毒副作用评估，同时克服不同SCLC患者之间的个体差异，而SCLC可视化PDOX小细胞肺癌模型的出现为临床治疗提供一个个性化治疗的手段[19]。

2.1 SCLC可视化PDOX裸鼠模型的构建 裸鼠是肿瘤动物模型中最常用的一种免疫缺陷小鼠。李一鸣[20]构建个体化裸鼠荷人肺癌动物模型肿瘤组织的基因突变和表达状况各不相同，进一步证实其具备个体化特征，该动物模型可作为今后研究肺癌个体化治疗的工具。张桢等[21]利用裸鼠构建SCLC动物模型来检测S100A2的阳性表达。但当时的建模技术还没有采用可视化PDOX模型技术，在国外应用比较多。Kiyuna等[22]采用绿色荧光蛋白技术（GFP）建立PDOX裸鼠模型来研究恶性肿瘤的动态演变，这种模型无创且避免动物的伦理学问题，也是目前国内外最为推崇的肿瘤动物模型。

2.2 SCLC可视化PDOX SCID小鼠模型的构建 SCID小鼠是有自发重症联合免疫缺陷突变的白化品系，这种突变使得T细胞和B细胞的发育成熟受到限制。SCID小鼠模型具有T淋巴细胞与B淋巴细胞联合功能缺失的优势，同时该模型在肿瘤学、免疫学、微生物学、生殖医学等领域研究中得到广泛应用，是PDOX模型的良好宿主[23-25]。

2.3 SCLC可视化PDOX NOD-SCID小鼠模型的构建 与普通SICD相比NK细胞活性低，具有更低的免疫恢复概率。NOD-SCID小鼠既有先天免疫缺陷，又有T淋巴细胞和B淋巴细胞缺乏的特征，适合肿瘤细胞植入培养，同样也是可视化PDOX小细胞肺癌理想的建模对象[26-27]。

2.4 SCLC可视化PDOX CBA/N小鼠模型的构建 CBA/N小鼠B淋巴细胞功能缺陷，位于X性染色体上xid基因出现缺陷突变。CBA/N小鼠对非胸腺依赖性Ⅱ型抗原没有体液免疫反应[27]。该类小鼠虽也是免疫缺陷，比较适合B淋巴细胞血液肿瘤的研究，但不适合应用于小细胞肺癌（SCLC）动物模型的构建。

2.5 SCLC可视化PDOX Beige （bg）小鼠模型的构建 bg小鼠是细胞活性缺陷的突变系小鼠，在第13号染色体上的隐性遗传基因bg发生突变引起[28]。该类模型的NK细胞功能缺陷，其免疫抗肿瘤杀伤作用比较弱，缺乏细胞毒性T细胞功能，并且对同种或异种肿瘤细胞的体液免疫功能减弱，欠缺巨噬细胞的抗肿瘤活性等。该类模型对各种致病因子较敏感，需良好SPF环境[29]。上述5种可视化PDOX小细胞肺癌（SCLC）实验对象模型的优势与不足比较见表2。

3 免疫表型Ki-67在小细胞肺癌中表达的监测应用

小细胞肺癌（SCLC）治疗手段单一且缺少有效的疗效预测指标[30-31]，而Ki-67在多种恶性肿瘤中呈高表达状态，也是细胞增殖常用的检测指标，并可作为疗效预测指标。

Ki-67对于患者来讲，所长组织是良性或者恶性，其增殖情况有所不同，它通常在肿瘤良恶性的鉴别和肿瘤增殖的情况当中有所使用，比如对于免疫组化的辅助诊断和日后的判定;通常情况下，良性肿瘤大概增殖大于5%或者小于10%左右，恶性肿瘤一般情况下细胞增殖大于10%，但是有一些低度恶性的肿瘤，其Ki-67的表达率可能低于5%，大部分情况Ki-67的增殖，随着肿瘤细胞的恶性程度增高而增加;其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可缺少，但其确切机制尚不清楚。

3.1 Ki-67在临床SCLC患者中的监测应用 早期数据表明，如果确诊后未进行积极治疗，SCLC患者的生存期仅为2～4个月[32]。近年来SCLC患者的生存期略有改善，局限期和广泛期患者的中位生存期分别为15～20个月和8～13个月[33]。SCLC的诊断和治疗已进入分子分型时代，但SCLC分期仍遵循美國退伍军人肺癌协会标准[34]。将SCLC分为局限期和广泛期，尚缺乏有效的指导预后的标志物，临床迫切希望能够有更加细致的指标用于指导SCLC的治疗及监测预后。SCLC是神经内分泌肿瘤的重要组成部分，但目前尚未将Ki-67纳入SCLC的分型及预后评估。有研究发现，当Ki-67数≥60%时，疾病进展快，恶性程度高，预后不佳，由此提出将Ki-67是否大60%定为临床分期及评估预后的界限。

3.2 小细胞肺癌Ki-67在实验肿瘤模型中的监测应用 马连君等[35]采用组织块悬液注射法构建肺内肿瘤种植模型，观察该肿瘤动物模型在不同时间点肿瘤细胞Ki-67阳性率。文献[36]报道想要探究小细胞肺癌临床化疗中G31P和吉非替尼的抑制机制和疗效评估，就利用荧光技术来检测裸鼠模型SCLC组织的Ki-67表达水平，充分地体现了SCLC与Ki-67免疫表达存在有统计学意义的相关性，对SCLC的早期免疫诊断以及疗效预测提供了新的思路。

4 可视化PDOX小细胞肺癌肿瘤动物模型与免疫表型Ki-67表达检测的组合应用

现在很多实验研究越来越倾向于将多种拥有特征的动物模型融合成一个更具有完善性和兼容性的标准化肿瘤动物模型，这种模型的好处就是能从一开始在临床上模拟患者早期肿瘤诊断，同时观察患者体内肿瘤病情的发展状况，给予该类肿瘤动物模型药物治疗，观察其药物反应，毒副作用，免疫应答以及疗效评估[37-40]。总而言之，就是能高度还原该小细胞肺癌患者肿瘤体外发生发展的全过程，这样对于临床的治疗比较有精准化和整体化。同时，也能够帮助肿瘤患者进行化疗时对于抗肿瘤药物的筛选，节省很多时间，避免了化疗后期出现耐药再盲目性随机试验性治疗的风险，极大地为小细胞肺癌患者争取了治疗时间，使得在小细胞肺癌在发生转移前进行有效的免疫检查点的抑制干预，从而提高肿瘤患者的生存率。

目前，SCLC的早期临床诊断方式多为免疫组化的方式[41]。有很多文献数据分报道和循证医学验证Ki-67表达阳性率与SCLC存在有诊断价值的相关性，且在预测患者1年生存率方面具有一定的价值，可为临床评估肿瘤侵袭及预后提供循证支持[42];SCLC可视化PDOX模型构建方向是为了高度模拟临床肿瘤患者个体情况以及药物筛选和药物应答机制研究，前者运用于早期小细胞肺癌快速诊断，后者运用于临床抗肿瘤药物个性化治疗。两者的结合模型构建极大地促进临床肿瘤化疗的时效性和新的靶向药物的研发[43-44]。

虽然很多肿瘤动物模型的兼容性不佳，存在很多特异性较差，有建模效果不理想的情况，存在实验对象的匹配性的筛选整合难度大以及试验方法的改进完善，但是我相信在未来还有更多特征的标准化肿瘤动物模型进行融合构建，研究人员正在不断地探索多方位的肿瘤动物模型的构建技术，这也是一种前沿可视化PDOX肿瘤动物模型构建技术的发展趋势[45]。

5 总结

Ki-67阳性表达率升高均参与SCLC的发生发展，同时SCLC肿瘤侵袭转移特性存在密切相关性，有利于SCLC的早期诊断和预后评估;另外它们作为肿瘤的潜在标志物，将会成为推动SCLC研究进展的新动力，同样可视化PDOX肿瘤动物模型将会是它表达验证的一个理想载体。该模型的构建技术是现在国际上认可的最为前沿的肿瘤动物模型，技术的不断进展，更多综合干扰因素的排除，更多优势的整合，一个更贴近临床患者的体外肿瘤细胞生长微环境培养技术在不断完善和提高[46]。有相关研究进一步通过随访发现通过检测Ki-67的阳性表达情况，可能用于SCLC患者预后评估，有可能成为SCLC患者诊断治疗的新靶点[47]。通过建立人SCLC的模型，探讨其用于人SCLC的治疗研究的可行性，同时为人SCLC实验性治疗的研究提供一种高效的实验模型。该标准化动物模型的成功构建将会进一步地深入研究临床中SCLC患者个体之间的药物耐药机制和药物免疫应答研究，能够在早期对SCLC患者进行干预治疗，达到精准医疗的效果，为临床医生提供更加个性化诊疗思路，大大降低患者的死亡率，延长其生存周期。

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（收稿日期：2020-09-15） （本文编辑：田婧）