基于线粒体控制区D-loop序列的内蒙古大鳍鼓鳔鳅群体遗传结构分析

杨艳平 杨丽文 乌兰 缪丽梅 罗旭光

(1 内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2 包头黄河国家湿地公园管理处，内蒙古包头 010010；3 内蒙古自治区水产技术推广站，内蒙古呼和浩特 010018)

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是1种闭合、环状的双链 DNA 分子，具有进化速度快、分子量小、结构简单稳定、便于研究等特点，是研究种群遗传结构的理想材料[1-2]。线粒体控制区又称D-环区(D-loop)，为非编码区，是整个线粒体基因组变异最快和长度变异最大的区域[3]，具有进化速度快、遗传变异大的特点[4]。近年来许多学者以测序技术为基础，以D-loop作为分子标记对鱼类遗传结构进行了广泛研究[5-8]，这对于鱼类种群保护和管理具有重要的意义。

大鳍鼓鳔鳅[Hedinichthysyarkandensismacroptera(Herzenstein)]隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、条鳅亚科(Nemacheilinae)、鼓鳔鳅属(Hedinichthys)，是1种较为古老的大型鳅科鱼类，属于内蒙古地区特有的鱼类资源，在当地俗称“大头鱼”。该鱼为底栖鱼类，通常在湖泊深处活动，主要以小型鱼类、虾、各类水蚤和水生昆虫为食[9]，目前仅分布在我国第二大内陆河黑河的中下游水域，且较为集中地分布于内蒙古自治区阿拉善盟额济纳旗境内的居延海(苏泊淖尔)。20世纪60年代，内蒙古境内黑河断流造成居延海干涸，大鳍鼓鳔鳅在该地区几近绝迹。2004年，随着黑河改水工程的进行，居延海正式蓄水，大鳍鼓鳔鳅又在居延海出现，并有小规模的产量。大鳍鼓鳔鳅肉质细嫩，味道鲜美，具有生长较快、抗寒抗碱能力强、适应性强等优点，是内蒙古等西北地区高寒高盐碱湖泊的理想养殖对象，对于高盐碱水体资源开发具有重要的意义。目前已有大鳍鼓鳔鳅生物学特性及人工繁殖方面的报道[10-13]，但运用D-loop区序列分析大鳍鼓鳔鳅种群遗传多样性的研究鲜见报道。本研究运用线粒体D-loop区序列对采自内蒙古居延海及附近水域的52个大鳍鼓鳔鳅样本进行了遗传多样性和遗传分化分析，为开展内蒙古地区野生鱼类遗传资源调查、丰富该地区淡水鱼类种质资源基础数据提供支持，同时为保护大鳍鼓鳔鳅物种生态稳定性和遗传多样性，以及后续资源保护提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用大鳍鼓鳔鳅共52尾，采自内蒙古居延海及附近水域。对试验鱼进行形态学测量、称量、编号，活体解剖后，取其肝脏等组织器官储存于95%乙醇溶液中，并置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 基因组DNA的提取和鉴定

将保存的标本取出，置于无菌蒸馏水中浸泡3 h以上。用组织匀浆仪将组织打碎，取匀浆后的组织约100 μg，采用Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒提取基因组DNA。用微量紫外分光光度计测量基因组DNA在260 nm和280 nm处的吸光度以及质量浓度。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和纯度。

1.3 引物设计

设计扩增D-loop区域的引物[14-15]，上游引物序列为DF1：5'-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3'；下游引物序列为DR2：5'-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3'。所有引物由生工生物(上海)工程有限公司合成。

1.4 PCR扩增和序列测定

序列扩增试剂使用Takara Premix PrimeSTAR HS。反应总体积50 μL：PCR Premix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，灭菌水22 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，共25个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下将扩增良好的条带进行切胶回收，用天根DP209-03柱式胶回收试剂盒纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物送至生工生物工程有限公司(上海)进行测序。

1.5 数据处理

对测定的DNA序列进行人工校正，采用DNAMAN 5.2.2软件进行个体和鱼类群体间的序列比对，分析序列的核苷酸碱基组成、位点变异；采用MEGA 5.1软件进行系统进化树、遗传距离、GC含量等分析。利用DnaSP v5软件分析基因多态性及单倍型，获得群体序列遗传多样性参数，包括单倍型数(h)、单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(π)。

2 结果和分析

对52个标本的D-loop区进行了序列测定，得到约947 bp的序列片段，电泳显示扩增条带单一，未发现非特异性条带，试验结果重复性较好，无外源 DNA 污染(见图1)。

2.1 D-loop序列特征分析

2.1.1 碱基含量分析

在947 bp的D-loop序列中，碱基A、T、C、G的平均含量分别为34.5%、28.0%、21.3%、16.2%，其中G+C碱基平均含量(37.5%)明显低于A+T碱基含量(62.5%)，具有明显的碱基组成偏向性。具体结果见表1。

表1 大鳍鼓鳔鳅所测样本的线粒体D-loop区的G+C含量

2.1.2 序列变异分析

在52个样本中发现D5、D8、D9、D11、D12、D14、D17、D19、D21、D22、D23、D24、D25、D26、D32、D33、D34、D35、D36、D40、D41、D42、D43、D46、D49、D50、D51等27个样本在645位点均缺失C碱基，突变总数为21；D-loop序列存在多态性位点/突变位点20个，单倍型数(h)为17，单倍型多样性(Hd)为0.912，核苷酸多样性(π)为0.0045。

2.2 遗传多样性和遗传分化

2.2.1 系统进化分析

用MEGA 5.1软件的Maximum Likelihood方法进行系统进化树分析，样本共分为2支，对应的样本数分别为31和21个，说明大鳍鼓鳔鳅群体结构出现了一定的遗传分化(见图2)。

2.2.2 遗传距离计算分析

遗传距离计算结果显示，52个样本的D-loop区的平均遗传距离小于0.010，说明个体间的亲缘关系较近。

3 讨论

作为内蒙古地区的特有鱼类，大鳍鼓鳔鳅是该地区生物多样性的重要组成部分[10]。同时，作为当地“赏胡杨林，品大头鱼”的旅游特色之一，大鳍鼓鳔鳅也是当地最重要的经济鱼类之一。因此，对大鳍鼓鳔鳅开展资源保护显得尤为重要。

大鳍鼓鳔鳅D-loop区碱基组成为A(34.5%)、T(28.0%)、C(21.3%)、G(16.2%)，碱基呈现不均一的分布，其中G+C碱基的平均含量(37.5%)显著低于A+T碱基的含量(62.5%)，具有明显的碱基组成偏向性。这与其他鱼类线粒体DNA的蛋白质编码基因的特点一致[16-18]。

遗传多样性(genetic diversity)是生物多样性的重要组成部分，与物种的适应能力、生存能力和进化潜力等密切相关[19-20]。掌握物种的遗传多样性水平可以为制订针对性的保护和管理策略提供科学依据[21]。单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(π)是进行遗传多样性研究的2个重要参数[22]。本研究针对内蒙古大鳍鼓鳔鳅线粒体D-loop区序列进行分析，分析其群体遗传多样性和遗传结构，结果显示，基于D-loop 区的大鳍鼓鳔鳅的单倍型数(h)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)分别为17、0.912和0.004 5，显示出较高的遗传多样性。与大鳍鼓鳔鳅Cytb基因序列相比，基于 D-loop 区序列的种群突变位点数以及多态性位点的比例要高于Cytb基因[23]。这说明D-loop区序列与Cytb基因相比，发生突变的位点更多，突变机率更高，可能是因为鱼类的线粒体 D-loop 区序列所受的选择压力较小、进化速率较快，而Cytb基因作为线粒体编码基因，其进化速度相对较慢[14]。

Grant等[24]根据Hd和π，分别以0.5和0.005为界限，将鱼类进化情景分为 4 种类型：低Hd和低π，高Hd和低π，低Hd和高π，低Hd和低π。整体来看，基于 D-loop 区序列的大鳍鼓鳔鳅的遗传多样性呈现出高Hd和低π的特征，其高Hd的特征接近于遗传多样性较丰富的长薄鳅(Hd=0.916)[25]、长江上游特有鱼类红唇薄鳅(Hd=0.967)[26]和高邮湖湖鲚(Hd=0.906)[27]等，而高于北江大刺鳅(Hd=0.541)[8]和异鳔鳅鱼它(Hd=0.817)[28]；其低π的特征高于异鳔鳅鱼它(π=0.002)，与长薄鳅(π=0.004 50)[25]相同，低于红唇薄鳅(π=0.006 7)[26]、高邮湖湖鲚(π=0.006 27)[27]及北江大刺鳅(π=0.008 17)[8]等。由此可见，内蒙古地区大鳍鼓鳔鳅种群的mtDNA D-loop序列表现出较高的遗传多样性水平。有学者推测，类似的遗传多样性现状可能是由1个较小的有效种群经历“瓶颈效应”或“建群效应”后迅速增长而造成的，尽管变异导致了单倍型多态性的积累，但还未能导致其核苷酸序列多样化的积累[29-30]。

20世纪60年代，黑河断流造成西居延海干涸，至1992年，居延海也相继干涸，使大鳍鼓鳔鳅在这一主要分布地区几近绝迹。2002年，为保护西北地区生态环境和治理黑河流域，黑河改水工程开始实施。2004年居延海正式蓄水后，大鳍鼓鳔鳅又出现了，并有小规模的产量。但由于蓄水时间短，鱼类资源还未能完全恢复和有效增加，大鳍鼓鳔鳅种群总体数量仍较小，尤其大型个体较少，与居延海干涸前的群体规模差距很大。人类的经济活动和酷渔滥捕，以及不科学的养殖方式和繁殖技术等严重破坏了大鳍鼓鳔鳅种群的多样性，严重威胁到该物种的生存。因此，应加强对大鳍鼓鳔鳅种质资源的评估，加大保护力度，进行合理的开发利用，以保持其遗传多样性，增大该资源恢复和提纯复壮的机会。