刀鲚MSTN基因遗传多态性与生长性状的关联分析

于爱清 施永海 徐嘉波

(上海市水产研究所，上海市水产技术推广站，上海 200433)

刀鲚(Coiliaectenes)又名长颌鲚，俗称刀鱼、毛刀鱼，隶属于鲱形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鲚属(Coilia)，富含以γ-氨基酸为代表的活性氨基酸和不饱和脂肪酸，具有较高的经济、营养和养殖价值。历史上我国长江刀鲚的自然种质资源极为丰富，加上其渔汛相对稳定，因而成为长江流域中下游的重要捕捞对象。近年来，由于酷渔滥捕、水域环境污染、水文条件改变、生态环境恶化和海岸工程建设等因素，长江刀鲚的自然种质资源急剧衰退，年捕获量波动很大，呈现出年获量逐年降低且个体小型化的趋势，甚至无法形成优势种群，对刀鲚种质资源进行保护和恢复已迫在眉睫[1-2]。随着我国刀鲚规模化人工繁养技术的突破，其养殖产业的规模日趋扩大，但是在养殖生产过程中，仍然存在生长速度减慢、应激性能差异大、大小规格分化严重和良种匮乏等问题，严重制约了长江刀鲚产业化的进程。因此，亟需培育生长快、抗逆性强的新品系以促进刀鲚养殖产业的可持续发展。

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)又称为生长分化因子-8(growth and differentiation factor 8，GDF-8)，是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的重要成员，能够通过抑制生肌决定因子家族成员的转录活性来调控肌肉细胞的生长发育[3-4]。MSTN基因最初由McPherron等[5]从小鼠的骨骼肌细胞中分离获得，并被鉴定为肌肉生长发育的负调控因子。后续的研究证实，敲除MSTN基因的小鼠肌肉质量是正常野生型小鼠的2～3倍[6]，且缺失突变纯合体的小鼠产生了类似于比利时蓝牛(Belgian Blue)、皮埃蒙特牛(Piedmontese)等家畜品种的双肌表型[3-4]。在水产动物研究领域，基于基因编辑技术或RNAi技术抑制水产动物MSTN基因的功能，亦能够导致青鳉(Oryziaslatipes)[7]、斑马鱼(Daniorerio)[8]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[9]等试验鱼类的肌肉明显发达于正常鱼，证实了MSTN基因能够负调控鱼类肌肉的生长和发育，在鱼类良种选育方面具有重要研究价值。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指在基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、T、C或G)的突变而引起的多态性，具有数量多、分布广、遗传稳定性强、二等位性及易于自动化检测等优点，被广泛应用于水产动物标记辅助选择、QTL定位和动植物遗传图谱构建等方面的研究中[10-11]，具有巨大的潜力和应用前景。在水产动物育种过程中，基于生长相关候选基因的多态性与生长性状的关联分析结果，筛选出与生长性状显著相关的位点，有助于在繁育亲本的早期培育过程中进行有效地筛选，从而提高选育效率，缩短良种培育进程。目前，SNP分型的方法主要有直接测序法、TaqMan探针法、PCR-LDR分型技术、PCR-RFLP法、飞行质谱检测法和SNaPshot分型技术等。其中，SNaPshot基因分型方法，又被称为小测序，主要是基于荧光标记单碱基延伸原理而获得样本精准基因型的中通量SNP分型技术，被广泛应用于大口黑鲈(Micropterussalmoides)[12]、草鱼(Ctenopharyngodonidella)[13]及尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[14]等水产动物SNP位点的检测和分型研究。基于MSTN基因在遗传育种上的潜在应用价值，从无脊椎动物到脊椎动物研究领域的相关报道，以及其被作为重要经济物种遗传改良重要候选基因[3]的研究背景，本研究将MSTN基因作为刀鲚生长性状遗传改良的重要候选基因，对其进行多态性检测与分型，并将基因多态性与刀鲚的生长性状进行关联分析，旨在筛选出能够应用于长江刀鲚生长性状遗传改良的分子遗传标记，为培育种质优良的刀鲚新品系提供理论基础和依据。

1 材料和方法

1.1 材料

试验用刀鲚来自上海市水产研究所(上海市水产技术推广站)奉贤科研基地。于2017年基于群体选育方法获得繁育子代，同塘养殖2年后，随机选取100尾刀鲚，用游标卡尺和电子天平测得其平均体长为(21.89±4.51)cm、平均体高为(3.40±0.74)cm、平均体质量为(39.83±22.73)g。剪取部分样品尾鳍分别编号并置于装有95%乙醇的2 mL离心管中，-20 ℃保存备用。

1.2 基因组DNA的提取

每个试验样品取25 mg左右，经灭菌ddH2O清洗后，剪碎置于1.5 mL离心管。参照天根生化科技(北京)有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324-03)的说明书，提取不同刀鲚样品的基因组DNA。根据琼脂糖凝胶电泳和NanoVue Plus紫外可见分光光度计的检测结果评估样本DNA的质量和浓度。取凝胶电泳检测显示条带清晰、无拖尾降解现象、且OD260 nm与OD280 nm的比值在1.8～2.0的DNA样品，将其稀释到50 ng/μL后，保存于-20 ℃冰柜中备用。

1.3 PCR引物设计及多态性SNP位点的筛选

根据刀鲚MSTN基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0软件设计5对PCR引物(见表1)。其中Ce-MSTN-FL1和Ce-MSTN-FL2是参照大西洋鲱MSTN基因内含子和外显子的相对位置设计而成，用于扩增刀鲚MSTN基因的第1内含子和第2内含子序列；Ce-MSTN-SC1、Ce-MSTN-SC2和Ce-MSTN-SC3则以刀鲚MSTN基因组DNA序列为基础设计而成。然后，以具有极端生长表型的20尾刀鲚[即体质量最大的10尾鱼(89.53±14.51 g)和最小的10尾鱼(18.75±1.62 g)]的DNA样本为模板，利用直接测序法筛选刀鲚MSTN基因组DNA上的多态性位点。

1.4 PCR扩增、测序和SNP分型

PCR扩增反应总体积为50 μL，包括2 μL的基因组DNA(50 ng/μL)、25 μL 2×Taq PCR MasterMix[1.25 UTaq聚合酶、500 μmol dNTP、20 mmol Tris-HCl(pH=8.3)、100 mmol KCl和3 mmol MgCl2]、2 μL的正引物(10 pmol/μL)、2 μL反向引物(10 pmol/μL)，最后用ddH2O补充总体积至50 μL。采用Eppendorf Mastercycler X50s PCR扩增仪进行扩增，PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，50～65 ℃(基于梯度PCR所获得的引物最适退火温度)退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，合格的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。20尾刀鲚样品的测序结果利用BioEdit软件进行序列比对，并结合测序峰值图筛选潜在的SNP位点。基于SNP位点筛选结果，设计特异性的PCR扩增引物(见表1)，委托上海捷瑞生物工程有限公司利用SNaPshot基因分型技术对100尾2龄刀鲚进行SNP位点检测和分型。

表1 刀鲚MSTN基因全长扩增及SNPs位点的筛选和检测引物

1.5 SNP位点与性状的相关性分析

利用GenAlEx 6.5软件[15]计算刀鲚养殖群体的有效等位基因数(effective number of alleles，NE)、观测杂合度(observed heterozygosity，HO)、期望杂合度(expected heterozygosity，HE)等遗传参数，并对分析SNP位点进行哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检验。利用PIC_CALC软件计算试验群体中每个SNP位点的多态信息含量(polymorphic information content，PIC)。利用SPSS 20.0软件中的一般线性模型(general linear model，GLM)分析每个SNP位点的不同基因型与刀鲚生长性状(体质量、体高和体长)之间的关联程度。差异显著性水平设置为0.05。

2 结果

2.1 刀鲚MSTN基因扩增和SNP位点的筛选

刀鲚MSTN基因全长3 278 bp，由2个内含子和3个外显子组成，其中第1、2内含子分别由578和454个碱基组成，均符合GT-AG原则；第1、2和3外显子由456、368和1 422个碱基组成(见图1)。经SNP位点筛选，仅在第1内含子上筛选到3个SNP位点(g.564G>T,g.755G>T 和 g.786C>T)，它们在刀鲚MSTN基因上的位置如图1所示。基于突变位点测序峰值图能够有效进行等位基因的纯杂合分型，在本研究中，峰值图为单峰的均为对应基因型的纯合子(G/G、T/T和C/C)，而峰值图为套峰的则代表该位点为杂合子(G/T、G/T和C/T)(见图2)。

2.2 不同SNP位点与生长性状的关联分析

刀鲚MSTN基因上的3个SNP位点共9种基因型分别与刀鲚的生长性状(体质量、体长和体高)的关联分析结果见表2。可以看出，位点g.564G>T的3种基因型个体的体质量、体长和体高的比较结果一致，均是GT>GG>TT，其中3种基因型个体的体质量和体长没有显著差异(P>0.05)，仅TT基因型个体的体高显著小于GT型个体(P<0.05)。位点g.755G>T的3种基因型个体的体质量、体长和体高的比较结果一致，均是GT>TT>GG，其中3种基因型的个体的体质量和体长没有显著差异(P>0.05)，仅GG基因型个体的体高显著小于GT型个体(P<0.05)。位点g.786C>T的3种基因型个体的体质量、体长和体高的比较结果一致，均是CC>CT>TT，其中CC型个体的体质量、体长和体高与CT型个体没有显著差异(P>0.05)，TT型个体的体质量、体长和体高与CC型和CT型个体的差异显著(P<0.05)。

表2 刀鲚MSTN基因的3个SNP位点与生长性状的相关性分析

2.3 SNP位点的群体遗传分析

刀鲚MSTN基因上的3个SNP位点在刀鲚养殖群体中的遗传多样性参数见表3。有效等位基因数(NE)为1.497～1.835，观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)分别为0.280～0.480和0.332～0.455，多态信息含量(PIC)为0.277～0.351，3个SNP位点均属于中度多态(0.250.05)。

表3 刀鲚MSTN基因上3个SNP位点的遗传参数分析

本研究所筛选到的3个SNP位点的基因型频率和基因频率见表4。从中可以看出，GT基因型在位点g.564G>T和g.755G>T中占据优势地位，而CC基因型在位点g.786C>T中占据优势地位；等位基因G、T和C分别为3个SNP位点的优势基因。结合3个SNP位点不同基因型的生长数据可以看出，具有优势基因型和基因的个体，其生长性状亦优于其他基因型和基因的个体。

表4 3个SNP突变位点在刀鲚养殖群体中的基因型和等位基因频率

3 讨论

MSTN作为抑制动物成肌细胞活化、增殖和分化的强化效应因子，其基因在不同物种间高度保守，在某些条件下部分位点发生突变或缺失能够导致抑制动物肌肉细胞生长的功能减弱，因其基因多态性往往与动物的生长、发育显著相关，而在动物性状遗传改良方面具有重要的应用研究价值[16]。MTSN基因多态性与经济性状的关联分析最初在牛、猪、鸡等禽畜类动物中研究较多，证实该基因的部分突变位点与不同的经济性状存在显著的相关性，能够应用于相关动物的分子标记辅助良种选育研究[11]。

在水产动物的研究方面，近年来，部分学者已在黄颡鱼(Pelteobagrusefulvidraco)[17]、大口黑鲈(M.salmoides)[12]、草鱼(C.idella)[18]、吉富罗非鱼[119]、金头鲷(Sparusaurata)[20]及中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]等重要的水产经济动物上开展MSTN基因多态性与生长性状的相关性研究，以期能够为相关水产动物良种的分子选育奠定理论参考与支持。本研究利用直接测序法在养殖刀鲚MSTN基因的第1内含子部分成功鉴定到了3个SNP位点(g.564G>T,g.755G>T 和 g.786C>T)，其中前两个突变属于颠换突变，位点g.564G>T中的GG、GT和TT基因型刀鲚个体分别与位点g.755G>T中的TT、GT和GG基因型个体相同，表明这两个突变位点是连锁的，且GT基因型个体的体高性状分别显著优于TT和GG型个体(P<0.05)。位点g.786C>T为转换突变，其TT基因型刀鲚的体长、体高和体质量性状均显著低于其它两种基因型(P<0.05)，CC基因型刀鲚的生长性状亦优于CT基因型，表明T等位基因的突变对于养殖刀鲚的生长性状具有不利影响。此外，本研究仅在养殖刀鲚MSTN基因的第1内含子部分检测到突变位点，而在其他内含子和外显子部分暂未检测到突变位点，表明养殖刀鲚的MSTN基因序列相对保守，内含子由于不参与氨基酸的编码，相对于外显子，其受到的选择压力亦较小，因而更易于发生位点突变。

大部分学者亦在其他水产动物MSTN基因的内含子部分检测到了与生长性状显著相关的SNP位点，与本研究的结果相一致。朱媛媛等[17]在黄颡鱼(P.fulvidraco)MSTN基因的第1内含子上鉴定到1个能够应用于雌性黄颡鱼生长性状改良的突变位点；俞菊华等[21]在建鲤(Cyprinuscarpiovar.jian)MSTN基因的第1内含子上筛选到1个与体型密切相关的SNP位点(T196G)；Wang Ying等[22]在红鳍东方鲀(Takifugurubripes)MSTN基因第2内含子上鉴定到1个与体质量、体长和体高性状显著相关的SNP突变位点(C1197T)，其CC基因型个体的体质量、体长和体高显著低于另外两种基因型的；唐永凯等[19]在吉富罗非鱼MSTN基因第2内含子的728 bp处发现了1个与体型(体厚/体长、体高/体长)存在显著相关(P< 0.05)的SNP突变位点(G/T)；张世勇等[23]在斑点叉尾鱼回(Ictaluruspunctatus)MSTN基因的第2内含子上发现了1个与体质量和体长呈显著性负相关的SNP位点(g.4355 G>C)，其GG基因型个体的体质量和体长显著低于另外两种基因型的。与这些研究结果不同的是，Sun等[24]在鲤鱼(C.carpioL.)MSTN基因的第3外显子上检测到2个与体质量和肥满度显著相关的SNP位点。以上研究证实，不同的试验对象，由于其所受到的选择压力及生存环境不同，因而产生了不同程度的遗传突变，导致同一基因上的SNP位点具有一定的物种差异性。虽然不同水产动物MSTN基因突变位点的位置和特性有所差异，但是均与相应水产动物的生长性状存在不同程度的相关性，这一发现有望应用于水产动物生长性状的遗传改良。

本研究利用直接测序法和SNaPshot基因分型技术，成功鉴定到了1个与养殖刀鲚的体长、体高和体质量性状显著相关的分子标记(g.786C>T)，该标记有望作为剔除劣质刀鲚繁育亲本的候选分子标记。考虑到鱼类的生长性状受多种基因的调控，后续将继续筛选更多与长江刀鲚生长性状显著相关的分子标记，用以制订更加科学、有效的长江刀鲚分子标记辅助育种策略。