清解抗感合剂质量标准研究*

张茹萍 何秀英# 凌益平 赵志良 李永盛

1 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

2 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

清解抗感合剂是本院医疗机构制剂，来源于预防新型冠状病毒肺炎、流感肺炎的临床经验方，由三叶青、荆芥、前胡、甘草等6味中药组成，具有疏风解毒、润肺止咳的功效。适用于素体肺卫气虚，易感风邪，有感冒、时行感冒易感史，或鼻咽不适，或微咳，舌红、苔薄白者。方中前胡具有降气化痰之功效，其主要化学成分为白花前胡甲素、白花前胡乙素等角型吡喃香豆素类成分，多用于治疗风热咳嗽痰多气喘的气管及支气管炎。为制定清解抗感合剂的质量标准，有效控制制剂质量，本研究采用TLC及HPLC对合剂进行研究，建立了稳定、可靠的定性和定量方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器：高效液相色谱仪（Agilent 1260，编号：DEAE203288），配有四元泵、DAD检测器、自动进样器、柱温箱；YMC-pack ODS-A色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；分析天平：BP211D型分析天平（十万分之一，Sartorius）；BS210S型分析天平（万分之一，Sartorius）；JM-B20002电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）；R-210旋转蒸发仪（BUCHI）；ZF-90型暗箱式紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂）。

1.2 试剂与药材：硅胶H、G、GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司），高效硅胶G薄层板（HSG,烟台江友硅胶开发有限公司）；定量毛细管（1μl，批号：889892），定量毛细管（2μl，批号：894179）均为HIRSCHMΛNN；白花前胡甲素（批号：111711-201904，纯度99.4%），甘草对照药材（批号：120904-201620），均购自中国食品药品检定研究院；三叶青（批号：190830），荆芥（批号：191210），前胡（批号：190918），麦冬（批号：190910），太子参（批号：191211），甘草（批号：200101），均由浙江桐君堂中药饮片有限公司提供。清解抗感合剂：200310、200316-2、200316-3、200408、200526、200702由本院制剂室自制。HPLC流动相中甲醇为色谱纯，购自Merck公司；纯水：娃哈哈纯净水；其余有机试剂为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 前胡的薄层色谱鉴别研究：分述如下。

2.1.1 对照品溶液的制备：取白花前胡甲素对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备：参考《中国药典》2015年版一部[1]556“小儿清肺化痰口服液”项下“前胡”的鉴别。取本品30ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次30ml，合并二氯甲烷液，浓缩至干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液制备：按工艺方法制备缺少前胡药材的阴性对照溶液。

2.1.4 检测方法及结果：吸取白花前胡甲素对照品溶液3μl、供试品溶液6μl及阴性对照溶液6μl，分别点于同一硅胶G薄层板，以石油醚（60～90℃）-二氯甲烷-乙酸乙酯（4∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。结果表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照在供试品和对照品色谱相应的位置上均无相同颜色的斑点。见图1。

图1 前胡的薄层色谱图

2.2 甘草的薄层色谱鉴别研究：分述如下。

2.2.1 供试品溶液的制备：参考《中国药典》2015年版一部[1]478“九味羌活丸”项下“甘草”的鉴别。取本品30ml，加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇层，加氨试液30ml洗涤，分取正丁醇层，回收溶剂至干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2.2.2 对照药材溶液的制备：参考《中国药典》2015年版一部[1]86“甘草”项下的鉴别。取甘草对照药材1g，加甲醇加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取两次，每次30ml，合并正丁醇层，回收溶剂至干，残渣加甲醇2ml溶解，作为对照药材溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备：按工艺方法制备缺少甘草药材的阴性对照溶液。

2.2.4 检测方法及结果：吸取对照药材溶液2μl、供试品溶液6μl及阴性对照溶液6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视。结果表明，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照在供试品和对照药材色谱相应的位置上无相同颜色的斑点。见图2。

图2 甘草的薄层色谱图

3 含量测定

3.1 色谱条件：流动相：甲醇-水（65∶35）；色谱柱：YMCPack ODS-A（250mm×4.6mm,5μm）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：321nm；进样量：10μl。

3.2 供试品溶液的制备：精密量取本品5ml，置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，6000r/min离心15min，取上清液作为供试品溶液。

3.3 对照品溶液的制备：精密称取白花前胡甲素对照品适量，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（106.66μg/ml）。

3.4 缺前胡的阴性供试品溶液的制备：按工艺方法制备缺少前胡药材的阴性样品，按“3.2”项下方法制备成缺前胡的阴性样品溶液。

3.5 专属性试验：精密量取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μl，按“3.1”项下色谱条件测定。由图3可知，阴性样品在主峰位置没有干扰，白花前胡甲素峰与相邻杂质峰分离度大于1.5。

图 3 HPLC色谱图

3.6 系统适用性：精密量取对照品溶液2ml，置10ml取量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，按“3.1”项下色谱条件连续进样6次，结果白花前胡甲素的理论塔板数为19420，峰面积的RSD=0.22%。

3.7 线性关系：精密量取对照品溶液（106.66μg/ml）0.5ml、1ml、2ml、3ml、5ml置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录主峰面积。计算得回归方程y=15.293x-5.8846，相 关 系 数 r=0.9999。表 明 其 在 5.333～53.33µg/ml线性关系良好。

3.8 仪器精密度试验：由不同人员制备样品，在不同的液相，分别重复进样6次，记录峰面积，所得12份的含量相对标准偏差RSD=1.39%，表明仪器精密度试验良好。

3.9 稳定性试验：取重复性试验的样品溶液，分别于0，1，2，4，8，12，24小时照“3.1”项下的方法测定，计算得RSD=0.57%，表明供试品溶液在24小时内非常稳定。

3.10 重复性试验：取本品5ml，平行6份，按“3.2”项下的方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱峰面积。结果显示，所得6份样品中白花前胡甲素含量的平均值为29.80μg/ml，RSD为1.59%，表明试验重复性良好。

3.11 加样回收率试验：精密量取本品2.5ml，平行9份，分别加入不同量的对照品溶液，加水至5ml，置于10ml取量瓶中，再加流动相稀释至刻度，摇匀，离心15分钟（每分钟6000转），取上清液照“3.1”项下的方法测定，结果见表1。各浓度下的平均回收率为101.56%，RSD=2.27%。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

3.12 耐用性试验：分别用3家不同品牌、性能相当色谱柱，调整柱温（30±5℃）、流速（1.0 ml/min±20%）以及检测波长（321±2nm），按照“3.1”项下的方法测定供试品溶液的含量。结果：主峰的拖尾因子小于2.0，主峰与相邻杂质峰分离度大于1.5，各条件下含量的RSD=0.60%。

3.13 含量测定：分别取不同批次的供试品溶液5ml，置10ml量瓶中，按“3.2”项制备供试品溶液，测定峰面积，计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

4 讨论

4.1 展开系统的考察：参考《中国药典》2015年版一部“前胡”[1]265、“咳喘顺丸”[1]1185项下“前胡”及相关文献 的 鉴 别 ；“ 甘 草 ”[1]86、“ 三 拗 片 ”[1]491、“ 小 儿 止 咳 糖浆”[1]526项下“甘草”的鉴别，分别用三种不同的展开系统对前胡和甘草进行考察。结果表明，分别以石油醚（60～90℃）-二氯甲烷-乙酸乙酯（4∶2∶1）、乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂时，前胡及甘草展开效果更佳。

4.2 薄层板的考察：比较国产硅胶G、H、GF254、烟台江友高效硅胶G薄层板（HSG）对展开效果的影响。结果表明，硅胶板是否有荧光剂或黏合剂对分离效果及比移值差异不大。

4.3 温湿度的考察：分别将层析缸置于4℃冰箱、25℃培养箱及40℃培养箱中用以考察温度对供试品溶液、对照品溶液及对照药材溶液的展开效果；用硫酸溶液将层析缸的相对湿度控制在42%和72%来考察不同湿度的展开效果。结果表明，低温和高温以及各相对湿度对分离效果略有影响，但差异不大。

4.4 其他药材的薄层色谱鉴别考察：荆芥的特征成分主要为挥发性成分，本品采用煎煮方式进行提取，挥发油损失较大，因此未能在该合剂中鉴别出荆芥药味。本实验选用不同的展开系统对麦冬对照药材、供试品溶液及缺麦冬的阴性供试品溶液进行研究，结果显示阴性有干扰，因此并未找到鉴别麦冬的专属性方法。