48 株枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病防治效果评测

白红燕，冯自力，冯鸿杰，魏锋，赵丽红，朱荷琴，顾爱星，张亚林*，彭军，*

（1.新疆农业大学农学院/ 棉花教育部工程研究中心，乌鲁木齐830052；2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的维管束系统性病害[1]，严重影响作物产量和品质，已成为影响我国棉花绿色发展的主要障碍[2]。 生物防治因其对环境污染小，对人畜安全、不易引起抗性等优点，成为防控黄萎病的重要手段。 目前，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等可产生耐热抗逆芽孢的一类细菌成为研究的热点[3-4]。 Mansoori 等[5]利用4 株芽孢杆菌对棉花种子进行包衣防治黄萎病，结果表明其中2 株芽孢杆菌可以显著降低发病率和病情指数；李社增等[6]研究发现， 枯草芽孢杆菌NCD-2 对棉花黄萎病的田间防治效果（防效）在70%以上，并且能改善棉花的纤维品质，该菌株已被开发为防治棉花黄萎病的微生物农药。 然而，枯草芽孢杆菌不同菌株的黄萎病防效参差不齐，有待进一步筛选验证[7]。

本研究从健康棉花植株及根际土壤中分离获得枯草芽孢杆菌菌株，采取对峙培养法和对扣培养法筛选具有较高拮抗活性的菌株，并利用温室试验验证其防效及对棉花的促生长作用，为枯草芽孢杆菌防治棉花黄萎病提供支撑，并为下一步开发生防菌剂产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

强致病力大丽轮枝菌Vd080，由中国农业科学院棉花研究所棉花病害研究课题组分离保存。试验选用耐黄萎病棉花品种鲁棉研21 号[8]。

48 株枯草芽孢杆菌： 来自中国农业科学院棉花研究所棉花病害研究课题组已建立的棉花生防菌种群资源数据库[9-10]。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）固体培养基、察氏培养基、Luria-Bertani（LB）固体培养基及液体培养基。

1.2 试验方法

1.2.1枯草芽孢杆菌的活化。将筛选到的枯草芽孢杆菌在LB 固体培养基上进行活化，选择单菌落接到LB 液体培养基中，置于37 ℃、150 r·min－1摇床培养24 h，获得枯草芽孢杆菌培养液，备用。大丽轮枝菌菌液制备：取直径为5 mm 的Vd080 菌饼转接到察氏培养基中，于25 ℃、150 r·min－1摇床培养7 d，获得Vd080 孢子悬浮液，备用。

1.2.2对峙培养测定枯草芽孢杆菌对大丽轮枝菌的影响。 在PDA 平板中心接种已经活化的直径为5 mm 的Vd080 菌饼， 然后在距离培养基中心20 mm 处对称放置2 个牛津杯，每杯内加入50 μL枯草芽孢杆菌培养液， 以单独接种Vd080 不加枯草芽孢杆菌培养液作为空白对照，每个处理重复5次。 25 ℃恒温培养观察抑菌情况，在第10 天，利用十字交叉法测定黄萎病菌菌落直径，利用下列公式计算抑制率（I）：I＝[（D1－5）－（D2－5）]/ （D1－5）×100%。 式中，D1和D2分别为空白对照和处理菌落直径（mm）[11]。

1.2.3对扣培养测定枯草芽孢杆菌对V.dahliae 的影响。 在PDA 平板中心接种已经活化的直径为5 mm 的Vd080 菌饼，在LB 固体平板上接种5 μL枯草芽孢杆菌培养液，将2 个平板对扣密封，以单独接种Vd080 与不加枯草芽孢杆菌培养液的LB平板对扣培养作为空白对照， 于25 ℃恒温培养箱培养10 d，观察抑菌情况，每个处理重复5 次。利用十字交叉法测定黄萎病菌菌落直径， 采用1.2.2 中公式计算抑制率。

1.2.4温室试验测定枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的防效。 浸种法：将蛭石、沙子、基质按质量比3∶2∶1 混合均匀后装入纸钵（直径6 cm，高度10 cm），棉苗培育和病原菌的接种方法参照蛭石沙子无底纸钵定量蘸菌液法[12]。 同时用枯草芽孢杆菌培养液浸泡鲁棉研21 号棉种12 h， 每个纸钵中播种8 粒棉种，每6 个纸钵为1 个处理，每个处理重复3 次，以无菌LB 培养基浸种作为对照。 播种后7 d 进行间苗，每钵保留5 株棉苗。 待1 片真叶初现后每纸钵接种10 mL 的Vd080 孢子悬浮液 （孢子含量为1×107mL－1），跟踪监测棉花长势情况，适时调查棉花黄萎病发病症状。

灌根法：待棉花1 片真叶初现后，用枯草芽孢杆菌培养液灌根，处理后3 d，每纸钵接种10 mL 的Vd080 孢子悬浮液（孢子含量为1×107mL－1），每6个纸钵为1 个处理，每个处理重复3 次，以等量清水灌根为对照。

接种病原菌后15 d 参照5 级分级标准调查发病情况，同时计算病情指数和防效[13]。 棉花黄萎病病情指数参考：DI＝Σ（Ni×i）/（N×4）×100，式中DI为病情指数，Ni为各级病株数，i为病级数值，N为调查总株数；E（%）＝（DI0－DI1）/DI0×100，式中E为防效，DI0为对照病情指数，DI1为处理病情指数。播种后60 d，每个处理随机选取15 株棉花测量株高、根长、鲜物质质量等生物量指标。

1.3 数据处理

数据处理和分析采用Microsoft Excel 2019、SPSS 26.0。 数据采用单因素方差分析和邓肯氏多重范围检验进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌非挥发性代谢产物对V.dahliae菌落生长的影响

由表1 可见，对峙培养结果表明，48 株枯草芽孢杆菌中抑制率大于40%的菌株有18 株， 分别是EBS01、EBS02、EBS03、EBS04、EBS05、EBS06、EBS07、EBS08、EBS09、EBS10、BS02、BS04、BS05、BS08、 BS12、 BS16、 BS18 和BS26， 抑 制 率 为40.05%～74.23%，占总数的37.50%。其中，EBS03、EBS07 和EBS10 菌株处理的大丽轮枝菌Vd080 菌落直径分别为1.51 cm、1.95 cm 和1.94 cm，抑制率分别为74.23%、63.01%和63.27%。 由图1 可知，空白对照中Vd080 生长正常， 而在接种枯草芽孢杆菌的处理中，Vd080 生长受到抑制。上述结果表明，EBS03、EBS07 和EBS10 菌株非挥发性代谢产物对V.dahliae的菌落生长有抑制作用。

图1 EBS03、EBS07 和EBS10 非挥发性代谢产物对大丽轮枝菌菌落生长的影响

表1 对峙培养下不同枯草芽孢杆菌菌株对Vd080 菌落生长抑制情况的比较

2.2 枯草芽孢杆菌挥发性代谢产物对V. dahliae菌落生长的影响

由表2 可知，对扣培养结果表明，48 株枯草芽孢杆菌中抑制率大于25%的菌株有3 株， 分别是EBS03、EBS09 和EBS10， 抑 制 率 在25.27%～64.15%。 如图2 所示，在空白对照中Vd080 生长正常，培养10 d 后菌落直径为5.13 cm；而在EBS03、EBS09 和EBS10 菌株处理中，Vd080 菌落生长受到抑制，菌落边缘呈不规则锯齿状，菌丝生长抑制率分别达到了64.15%、37.37%和25.27%， 表明EBS03、EBS09 和EBS10 菌株挥发性代谢产物对棉花黄萎病菌Vd080 的生长有抑制作用。

图2 EBS03、EBS09 和EBS10 挥发性代谢产物对大丽轮枝菌菌落生长的影响

表2 对扣培养下不同枯草芽孢杆菌菌株对Vd080 菌落生长抑制情况的比较

2.3 温室试验测定枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的防效

综合室内对峙、对扣培养试验结果，选择抑菌效果较好的18 株枯草芽孢杆菌进行温室试验，采用浸种法和灌根法测定其对棉花黄萎病的防效， 最终选择灌根处理中防效大于55%的菌株。表3 结果表明：浸种处理中，经EBS03、EBS07、EBS10 和BS04 菌株处理的棉苗病情指数分别为8.17、8.18、10.93 和12.85，与对照（34.51）相比分别降低了26.34、26.33、23.58 和21.66，防效在62.77%～76.31% ； 灌 根 处 理 中，EBS03、EBS06、EBS07、EBS10 和BS04 菌株与对照相比显著降低了棉花黄萎病病情指数，防效达到57.62%～87.10%。综上，枯草芽孢杆菌EBS03、EBS07、EBS10 和BS04菌株在2 种处理方法下对黄萎病均具有良好的防效。

表3 枯草芽孢杆菌浸种处理和灌根处理对棉花黄萎病的防治效果

2.4 浸种处理对棉花出苗及生长的影响

浸 种 处 理 的 种 子 中，BS08、BS12、BS16 和BS18 菌株处理的出苗率在80%以上， 高于对照（73.61%），表明以上4 个菌株对棉花出苗有明显的促进作用；此外，与对照相比，EBS03 和EBS10 菌株处理的棉苗，其株高、地上部鲜物质质量和总鲜物质质量差异显著， 分别增加了9.94 cm 和9.90 cm、0.85 g 和0.81 g、0.89 g 和0.86 g，增幅为78.08%和77.77%、113.33%和108.00%、107.22%和103.61%（表4）。 表明EBS03 和EBS10 菌株对棉苗的生长发育有促进作用。

表4 不同浸种处理的棉花出苗及生长指标比较

2.5 灌根处理对棉花生长的影响

EBS02、EBS03、EBS04、EBS05、EBS08 和EBS10菌株灌根处理的棉花根长为7.20～7.73 cm， 显著高于对照（5.60 cm）。EBS03、EBS07 和EBS10 菌液灌根， 对棉苗地上部鲜物质质量和总鲜物质质量有明显的促进作用， 分别增加了0.56 g、0.54 g、0.53 g和0.61 g、0.59 g、0.58 g， 增幅分别为69.14%、66.67%、65.43%和69.32%、67.05%、65.91%（表5）， 表 明EBS03、EBS07 和EBS10 菌株可以增加棉苗鲜物质质量。

表5 不同灌根处理下棉花生长指标的比较

3 讨论与结论

棉花黄萎病属于维管束病害， 由于其致病菌（大丽轮枝菌）寄主范围较广，并且存在明显的致病力分化，所以防治难度很大，至今尚未发现特效的防治药剂，主要依靠种植抗性品种与生物防治相结合的防治措施[14-16]。芽孢杆菌因具有耐受能力强、繁殖速度快、分布范围广等多方面的优点，成为防治棉花黄萎病的重要生防菌[17-20]。 陈丽华等[21]发现芽孢杆菌LH-L3 不但能促进植株的长势， 还可以抑制棉花黄萎病。大部分直接从植株中分离出的生防菌，可以较好地在植物体内定植。目前，利用芽孢杆菌来防治棉花黄萎病的实例很多，有些已经显现出乐观的应用效果[20,22]。虽然，枯草芽孢杆菌已广泛应用于防治棉花黄萎病，但枯草芽孢杆菌存在生防效果不稳定、见效慢、货架期短等问题，这就要求枯草芽孢杆菌不仅要兼备自身优点，还要兼备高效速效的优点。

本研究以从健康棉花植株和根际土壤中分离获得的48 株枯草芽孢杆菌为对象， 通过对峙培养和对扣培养，筛选出18 株对黄萎病菌Vd080 拮抗效果较好的枯草芽孢杆菌，其中EBS03、EBS10 菌株在对峙培养中对黄萎病菌的抑制率分别为74.23%、63.27%，在对扣培养中对黄萎病菌的抑制率分别为64.15%、25.27%。 无论浸种还是灌根处理，EBS03、EBS07、EBS10 和BS04 菌株对棉花黄萎病防效均大于55%。 对18 株枯草芽孢杆菌浸种处理后的棉苗生长发育进行评估， 发现EBS03 和EBS10 菌株浸种处理棉苗的株高、地上部鲜物质质量和总鲜物质质量指标表现优异，与对照相比分别提高78.08%和77.77%、113.33%和108.00%、107.23%和103.61%。 EBS03 和EBS10 菌株对棉花生长具有促进作用，并具有良好的防病效果。

综上，枯草芽孢杆菌EBS03 和EBS10 菌株对大丽轮枝菌的生长具有拮抗作用，能有效促进温室棉苗的生长发育， 降低黄萎病发病率和病情指数，具有进一步开发应用的潜力。