基于VEGF/VEGFR-2信号通路研究淫羊藿苷促进大鼠胫骨干骨折愈合的作用机制

郑州大学附属郑州中心医院 郑州 450000

骨折是指骨的力学连续性、完整性丢失，以骨折处疼痛、肿胀、功能障碍、异常活动等主要临床表现，是常见的外科疾病之一[1]。骨折愈合是极为复杂的组织学修复过程，其中血管新生贯穿于整个骨折愈合过程，从血肿机化期、原始骨痂形成期到骨痂改造塑形期都有血管新生的参与。临床已证实血液供应是影响骨折愈合情况的主要因素[2-3]，因此促进血管新生是加快骨折愈合的关键。淫羊藿苷（icariin，ICA）是提取自淫羊藿茎叶的总黄酮类物质，具有调节免疫功能、改善内分泌、抗肿瘤等多种药理学功能[4]。近年来有研究指出，ICA可通过激活血管生成信号分子，刺激血管新生，为骨折治疗提供新的可能[5]。血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGF/VEGFR-2）信号通路在血管新生过程中起着关键作用，研究证实该信号通路介导和参与了骨折愈合过程[6]。然而，目前鲜有基于VEGF/VEGFR-2信号通路研究ICA对骨折愈合影响的报道。鉴于此，本研究建立大鼠胫骨干骨折模型，研究ICA对大鼠胫骨干骨折愈合的作用并探讨相关机制，以期指导临床。

1 材料和方法

1.1 实验动物 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）雄性SD大鼠50只，8周龄，体质量（300±20）g，饲养于郑州大学实验动物中心 [实验动物使用许可证号码：SYXK（豫）2011-0001]，温度（23±2）℃，湿度（50±5）%，明暗周期12h/12h，所有大鼠适应性饲养7d。

1.2 药物、主要试剂和仪器 ICA购于上海源叶生物科技有限公司（批号：20120706）；复方骨肽注射液购于常州方圆制药有限公司（剂量：5mL/75mg，国药准字：H20065416）；戊巴比妥钠购于上海化学试剂总厂试剂二厂（批号：820219）；Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司（批号：79407）；RT-Kit逆转录试剂盒购于上海Roche公司（批号：4897030001）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司（批号：AR0146）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上样缓冲液购于上海雷浩信息科技有限公司（批号：B1007）；Tris缓 冲 液（Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20，TBST）购于南京安培化工科技有限公司（批号：SBJ-1020）；VEGF、VEGFR-2单抗均购于美国Abcam公司（批号：ab32152、ab245725）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购于碧云天生物技术有限公司（批号：A0208）。

数字化X线摄片机为美国hologic公司产品；BX51显微镜购于日本Olympus株式会社；Inveon Research Wofkplace软件购于德国西门子股份公司；Image Pro-Plus Software 6.0 IPP软件为美国微软公司产品；Electro Force 3200生物力学性能测试仪购于美国BOSE公司；Viva CT40微计算机断层扫描（microcomputed tomography，Mirco-CT） 机购于瑞士SCANCO Medical AG公司；ChemiDoc XRS化学发光成像分析系统为美国Bio-rad公司产品。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分组 参照文献[7]，采用锯开法建立大鼠胫骨干骨折模型。所有SD大鼠均以2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉，6%硫化钠于左下肢备皮后，以右侧卧位固定于造模台。碘伏消毒左足至左大腿上段，于胫骨结节下方2mm沿胫骨脊作1.5cm纵向切口，剥离外皮，继续沿胫骨脊外侧0.5mm位置将浅筋膜与深筋膜层纵向切开，游离胫骨前肌群，暴露胫骨外骨面。采用5mL注射器针头于胫骨髌韧带开口，插入克氏针沿髓腔达胫骨粗隆间，于胫骨中段前方最高点锯开约3mm左右缺损，缺损达骨髓腔，形成胫骨中段横行骨折。继续插入克氏针穿过骨折位置贯穿整个胫骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏针，将其远端埋于骨皮质下。以0.9%氯化钠溶液冲洗干净后逐层缝合切口，涂抹适量红霉素软膏，连续3d每天注射8万U青霉素以预防感染。术后即刻于大鼠麻醉状态下拍摄患肢X线片，建模成功标准：胫骨中段斜形或横形骨折，骨折端内固定效果理想，未发生明显移位。50只大鼠建模成功41只、失败9只，将建模成功的41只大鼠随机分为对照组 （10只）、ICA低剂量组（10只）、ICA高剂量组（10只）、阳性药物组（11只）。

1.3.2 术后干预 术后第2天开始进行干预，参照文献[8]结合前期研究确定ICA的剂量，ICA低、高剂量组分别为40mg/（kg·d）、80mg/（kg·d）。ICA采用0.9%氯化钠溶液溶解，以5mL/（kg·d）的剂量腹腔注射，1次/d。阳性药物组采用复方骨肽注射液治疗，取0.4mL溶于0.9%氯化钠溶液，以5mL/（kg·d）的剂量腹腔注射，1次/d。对照组以等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射，1次/d。各组均连续干预21d。

1.3.3 Mirco-CT活体扫描 干预第7、14、21天进行Mirco-CT活体扫描。扫描前以2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉，保持大鼠俯卧位，屈曲双下肢，使股骨纵轴平行于Mirco-CT床滑轨的移动轴，在心电监护下行活体扫描。扫描分辨率47μm，扫描电压80kV，电流500μA，旋转角度360°，扫描时间2 000ms，帧平均数6，扫描范围为骨折线上下5mm。采用标准体模校准扫描结果，围绕骨痂沿股骨纵轴取100个扫描层面，上下各50个，建立感兴趣区。采用Inveon Research Wofkplace软件定量分析获取的三维图像信息，计算样本骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）和骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）。

1.3.4 生物力学测试 末次行Mirco-CT活体扫描后脱颈处死大鼠，完全剥离左下肢胫骨，采用骨水泥固定其两端避免加载时旋转移位，取等长骨架，采用生物力学性能测试仪进行三点弯曲实验。以所取胫骨段中点为加载点，承载点跨距30mm，加载速度2mm/min，记录各组最大载荷。

1.3.5 血管新生情况观察 处死大鼠后，以骨折位置作为中心，上下各取5mm×5mm骨痂组织标本，以4%多聚甲醛固定24h，组织块常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，制作成厚度5μm的切片，脱蜡后苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光镜下拍照，采用Image ProPlus Software 6.0 IPP软件测定新生血管面积，并计数新生血管数量，在骨痂愈合平面单位视野内随机选取10个不相邻视野，计算每个视野平均值。

1.3.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（quantiative Real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR）法检测骨痂组织VEGF、VEGFR-2 mRNA相对表达量处死大鼠后取骨折位置骨痂组织50mg，Trizol法提取总RNA，逆转录得cDNA，鉴定后进行基因序列扩增，按照QRT-PCR SYBRⅡ试剂盒说明书设定反应体系，反应体系总共25μL，包括SYBR Premix Ex Taq 10.5μL，5μmol·L-1上、 下游引物各1μL，cDNA 2μL，ddH2O 10.5μL。反应条件：90℃预变性5min，95℃变性20s，55℃退火40s，72℃延伸60s，重复40个循环，72℃延伸5min。以β-actin为内参基因，采用2-△△CT法计算各目的基因相对表达量。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.7 Western blot法检测骨痂组织VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量 处死大鼠后取骨折位置骨痂组织50mg，充分研磨后冰上裂解30min，8 000r/min离心15min（离心半径10cm），BCA法测定蛋白浓度，取30μg待检测样本与等体积上样缓冲液混合，沸水浴5min，8 000r/min离心30min（离心半径10cm），取上清液，SDSPAGE分离后转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，加入稀释倍数为1:1 000的兔抗大鼠VEGF、VEGFR-2单抗稀释液，4℃摇床孵育过夜，TBST洗涤3次，加入稀释倍数为1:8 000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育2h，TBST洗涤3次后加入发光液，暗室显影，凝胶成像系统扫描分析条带灰度值，以目的条带/内参条带灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.4 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多样本资料组间比较采用单因素方差分析及重复测量方差分析，经Levene检验满足方差齐性者，采用单因素方差分析，以最小显著性差异（least significant difference，LSD）-t检验行两两比较；方差不齐者，采用Welch检验，再以Dunnett T3检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干预第7、14、21天各组活体Micro-CT结果比较 干预第7、14、21天，各组间总体比较，BV/TV、Tb.N差异有统计学意义 （P＜0.01）。与对照组比较，ICA低剂量组、ICA高剂量组、阳性药物组BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）；与ICA低剂量组比较，ICA高剂量组、阳性药物组BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）；与ICA高剂量组比较，阳性药物组BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）。随时间延长各组BV/TV均呈增高趋势，Tb.N呈增多趋势（P＜0.01）。见表2～3。干预第21天活体Micro-CT结果显示，对照组、ICA低剂量组骨折断端尚未完全吻合，骨折线明显，骨皮质外观连续性差，提示新生骨量较少；ICA高剂量组、阳性药物组骨折断端吻合良好，骨折线不明显，骨皮质外观较为连续，提示新生骨量较多。见图1。

图1 干预第21天活体Micro-CT结果Fig.1 In vivo micro-CT results on the 21st day of intervention

表2 干预第7、14、21天各组BV/TV值比较（±s）Tab.2 Comparison of BV/TV value on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s）

表2 干预第7、14、21天各组BV/TV值比较（±s）Tab.2 Comparison of BV/TV value on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ICA低剂量组比较，#P＜0.05；与ICA高剂量组比较，△P＜0.05；与同组第7天比较，▽P＜0.05；与同组第14天比较，◇P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05;compared with the same group on the 7th day，▽P＜0.05;compared with the same group on the 14th day，◇P＜0.05

组别 n 第7天 第14天 第21天对照组 10 0.19±0.04 0.24±0.05▽ 0.29±0.04▽◇ICA 低剂量组 10 0.24±0.05* 0.29±0.05*▽ 0.34±0.06*▽◇ICA 高剂量组 10 0.28±0.04*# 0.34±0.05*#▽ 0.40±0.05*#▽◇阳性药物组 11 0.34±0.05*#△ 0.39±0.04*#△▽ 0.46±0.07*#△▽◇F 值 F 组间=15.246，F 时间=19.712，F 交互=17.075 P 值 P 组间＜0.01，P 时间＜0.01，P 交互＜0.01

表3 干预第7、14、21天各组Tb.N比较（±s，1·mm-1）Tab.3 Comparison of Tb.N on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s，1·mm-1）

表3 干预第7、14、21天各组Tb.N比较（±s，1·mm-1）Tab.3 Comparison of Tb.N on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s，1·mm-1）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ICA低剂量组比较，#P＜0.05；与ICA高剂量组比较，△P＜0.05；与同组第7天比较，▽P＜0.05；与同组第14天比较，◇P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05;compared with the same group on the 7th day，▽P＜0.05;compared with the same group on the 14th day，◇P＜0.05

组别 n 第7天 第14天 第21天对照组 10 1.87±0.32 2.25±0.46▽ 2.69±0.39▽◇ICA 低剂量组 10 2.22±0.37* 2.65±0.40*▽ 3.08±0.41*▽◇ICA 高剂量组 10 2.70±0.39*# 3.10±0.43*#▽ 3.54±0.55*#▽◇阳性药物组 11 3.25±0.39*#△ 3.63±0.42*#△▽ 4.21±0.81*#△▽◇F 值 F 组间=10.711，F 时间=14.482，F 交互=12.270 P 值 P 组间＜0.01，P 时间＜0.01，P 交互＜0.01

2.2 各组生物力学测试结果比较 各组间总体比较，最大载荷差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组比较，ICA低剂量组、ICA高剂量组、阳性药物组最大载荷更大（P＜0.05）；与ICA低剂量组比较，ICA高剂量组、阳性药物组最大载荷更大（P＜0.05）；与ICA高剂量组比较，阳性药物组最大载荷更大（P＜0.05）。见表4。

表4 各组生物力学测试结果比较（±s，N）Tab.4 Comparison of biomechanical test results in each group（±s，N）

表4 各组生物力学测试结果比较（±s，N）Tab.4 Comparison of biomechanical test results in each group（±s，N）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ICA低剂量组比较，#P＜0.05；与ICA高剂量组比较，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

组别n最大载荷对照组 10 27.38±3.96 ICA低剂量组 10 36.92±5.07*ICA高剂量组 10 48.63±5.92*#阳性药物组 11 59.87±7.03*#△F值 62.125 P值 ＜0.01

2.3 各组新生血管数量、新生血管面积比较 各组间总体比较，新生血管数量、新生血管面积差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组比较，ICA低剂量组、ICA高剂量组、阳性药物组新生血管数量更多，新生血管面积更大（P＜0.05）；与ICA低剂量组比较，ICA高剂量组、阳性药物组新生血管数量更多，新生血管面积更大（P＜0.05）；与ICA高剂量组比较，阳性药物组新生血管数量更多，新生血管面积更大（P＜0.05）。见表5、图2。

图2 各组血管新生情况（HE染色，200×）Fig.2 Angiogenesis in each group（HE staining，200×）

表5 各组新生血管数量、新生血管面积比较（±s）Tab.5 Comparison of the number and the area of new blood vessels in each group(±s）

表5 各组新生血管数量、新生血管面积比较（±s）Tab.5 Comparison of the number and the area of new blood vessels in each group(±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ICA低剂量组比较，#P＜0.05；与ICA高剂量组比较，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

组别 n 新生血管数量（个/视野） 新生血管面积（μm2/视野）对照组 10 5.10±0.83 1 652.30±324.87 ICA 低剂量组 10 9.00±1.53* 3 567.90±587.21*ICA 高剂量组 10 11.50±2.86*# 6 092.10±896.30*#阳性药物组 11 16.80±3.52*#△ 8 847.30±1 246.35*#△F值 41.594 141.008 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.4 各组骨痂组织VEGF、VEGFR-2 mRNA相对表达量比较 各组间总体比较，骨痂组织VEGF、VEGFR-2 mRNA相对表达量差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组比较，ICA低剂量组、ICA高剂量组、阳性药物组VEGF、VEGFR-2 mRNA相对表达量较高（P＜0.05）；与ICA低剂量组比较，ICA高剂量组、阳性药物组VEGF、VEGFR-2 mRNA相对表达量较高 （P＜0.05）；与ICA高剂量组比较，阳性药物组VEGF、VEGFR-2 mRNA相对表达量较高（P＜0.05）。见表6。

表6 各组骨痂组织VEGF、VEGFR-2 mRNA相对表达量比较（±s）Tab.6 Comparison of relative expression content of VEGF and VEGFR-2 mRNA in callus tissue in each group（±s）

表6 各组骨痂组织VEGF、VEGFR-2 mRNA相对表达量比较（±s）Tab.6 Comparison of relative expression content of VEGF and VEGFR-2 mRNA in callus tissue in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ICA低剂量组比较，#P＜0.05；与ICA高剂量组比较，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

组别 n VEGF VEGFR-2对照组 10 0.18±0.03 0.19±0.03 ICA 低剂量组 10 0.30±0.05* 0.38±0.05*ICA 高剂量组 10 0.49±0.06*# 0.54±0.06*#阳性药物组 11 0.68±0.07*#△ 0.70±0.08*#△F值 166.562 144.748 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.5 各组骨痂组织VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量比较 各组间总体比较，骨痂组织VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组比较，ICA低剂量组、ICA高剂量组、阳性药物组VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量较高（P＜0.05）；与ICA低剂量组比较，ICA高剂量组、阳性药物组VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量较高（P＜0.05）；与ICA高剂量组比较，阳性药物组VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量较高（P＜0.05）。见表7、图3。

图3 各组骨痂组织VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量Fig.3 Relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 proteins in callus tissue in each group

表7 各组骨痂组织VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量比较（±s）Tab.7 Comparison of relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 protein in callus tissue in each group（±s）

表7 各组骨痂组织VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量比较（±s）Tab.7 Comparison of relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 protein in callus tissue in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ICA低剂量组比较，#P＜0.05；与ICA高剂量组比较，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

组别 n VEGF VEGFR-2对照组 10 0.12±0.03 0.10±0.02 ICA 低剂量组 10 0.29±0.04* 0.23±0.03*ICA 高剂量组 10 0.51±0.06*# 0.52±0.07*#阳性药物组 11 0.73±0.08*#△ 0.63±0.08*#△F值 228.939 194.775 P 值 ＜0.01 ＜0.01

3 讨论

骨折时，骨折断端与临近骨膜、血管受损，导致局部范围骨坏死。当骨折正确固定后，断端张力降低，断端破骨细胞开始管性吸收，形成新的Haversian管系统，为血管内皮细胞、血管周干细胞、成骨前体细胞、成骨细胞以及新生血管进入骨痂创造条件，从而促进软骨骨痂吸收、骨性骨痂形成、骨改建，实现骨折愈合[9-10]。骨折愈合是生物学、内分泌学、组织学、生物力学综合作用的动态过程，需要血管发生与骨发生之间精密、协调地配合，其中血管发生先于骨发生，而且是软骨成骨时期最为关键的环节[11]。因此，探寻安全、有效的促血管新生药物对加快骨折愈合至关重要。

本研究结果显示，与对照组比较，ICA低剂量组、ICA高剂量组、阳性药物组的BV/TV、新生血管面积、最大载荷均增大，Tb.N、新生血管数量均增加，提示ICA可增加新生骨量、促进血管新生，加快骨折愈合，并增强其抵抗外力冲击的能力。中医认为，骨折后肢体经络受损，血溢脉外，淤血不散，致经脉受阻、筋骨失养，骨折难愈[12]。肾主骨与髓，肾强则达骨和，淤散则达血新，筋骨得以濡养，气血旺盛，则骨愈合。淫羊藿味辛、甘，归于肾、肝经，具有补肾壮阳、祛风除湿、强健筋骨的功效。ICA是淫羊藿提取物中的主要有效成分，因其具有雌激素样结构，逐渐被作为植物雌激素类药物应用于抗骨质疏松治疗[13]。既往研究显示，ICA治疗老龄大鼠骨质疏松骨折，可促使骨密度显著回升，同时成骨标志蛋白表达明显上调，提示ICA对该病具有良好的治疗作用[14]。现代药理学研究显示，ICA可增强成骨细胞活性，同时促进类骨质钙化与骨折位置的血管生成[15-16]。本研究应用不同剂量的ICA干预胫骨干骨折大鼠后，新生骨量及新生血管增加，抗冲击能力增强，与ICA促进成骨细胞分化、血管生成等功效关系密切。

VEGF是一种具有特异性的强力血管新生诱导剂，可活化成纤维细胞，并促使其分泌基质，促进血管内皮细胞增殖、迁移，诱导血管生成。VEGFR-2是介导血管新生的重要信号传递分子，VEGF可与其结合，刺激血管内皮释放基质蛋白降解酶，诱导内皮细胞游离，促进血管新生。同时VEGFR-2有助于提升内皮细胞增殖、迁移能力，还参与血管通透性的调节，在骨折愈合早期即能够促使骨祖细胞聚集到骨折断端，加快骨愈合速度，而其他相关因子对血管新生的促进作用也全部或部分通过VEGF而实现[17]。Liu等[18]研究发现，肿瘤细胞中VEGF/VEGFR-2表达显著升高，VEGF/VEGFR-2信号通路抑制剂Apatinib可阻断该信号通路，从而抑制肿瘤血管生成。安晓晖等[19]采用穿山龙总皂苷治疗去势大鼠骨折时发现，大鼠骨痂处骨密度及新生血管数量均增加，且VEGF、VEGFR-2蛋白表达均上调，提示VEGF/VEGFR-2信号通路与骨折愈合相关。本研究结果显示，对照组、ICA低剂量组、ICA高剂量组、阳性药物组VEGF、VEGFR-2 mRNA及蛋白相对表达量依次升高，提示ICA对大鼠胫骨干骨折愈合的促进作用可能与激活VEGF/VEGFR-2信号通路有关。

综上所述，ICA可加快胫骨干骨折大鼠骨量新生，促进血管形成，增强抵抗外力冲击的能力，且其作用呈剂量依赖性，推测其作用机制与上调VEGF、VEGFR-2表达，激活VEGF/VEGFR-2信号通路有关。本研究结果为ICA应用于骨折治疗提供了理论基础，然而关于ICA对胫骨干骨折是否存在其他影响及相关机制仍需进一步探讨。