从调控TNKS2/APC蛋白探讨培土生金法对非小细胞肺癌转移干预的体外研究

浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053

近年来，随着发病率的不断上升，肺癌已成为癌症相关死亡的主要原因[1]，其中非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是肺癌常见的病理类型，约占肺癌发生率的85%[2]。近十年来，虽然NSCLC的诊断与治疗已经取得明显进展[3]，但晚期患者预后仍不佳，转移成为NSCLC患者治疗失败及死亡的主要原因。

中医认为肿瘤转移者，多是癌毒稽留而不去，同时攻伐太过，导致机体抗邪能力下降[4]，正气亏虚，免疫功能低下，免疫细胞难以杀灭循环肿瘤细胞[5]，以致肿瘤细胞转移、扩散。因此，正气亏虚是肿瘤转移的根本原因[6]。肺癌是一种全身属虚、局部属实的病证。晚期NSCLC患者虚症尤为明显，其中脾虚证是最常见证型，严重影响着患者的预后[7]。“培土生金”法通过补脾土生肺金，可明显提高患者的生存质量，延长生存期[8]。临床上，众多医家将培土生金法用于肺癌转移的防治，取得了较满意的效果[9-12]。黄土汤方源于《金匮要略》，其主要功效为温阳健脾、养血止血，临床实践中发现，以黄土汤为基础方治疗NSCLC转移具有一定的疗效，尤其对于咳血的患者作用更佳。本研究拟通过体外实验，进一步验证黄土汤抑制NSCLC转移的作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞 人NSCLC细胞株PC9、A549、H125、H647均由浙江省人民医院惠赠。

1.2 实验动物 无特定病原体（specified pathogen free，SPF）级雄性SD大鼠5只，6～8周龄，体质量（200±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号码：SCXK（沪）2012-0002]，饲养于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证号码：SYXK（浙）2013-0184]。

1.3 药物 黄土汤由甘草12g、干地黄60g、白术40g、炮附子40g、阿胶48g、黄芩48g、赤石脂240g组成，以上药物均由浙江中医药大学门诊部提供。

1.4 试剂 杜尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）购于杭州赛洛进生物科技有限公司（批号：8120130）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于上海生工生物工程股份有限公司 （批号：F815FA0001）；三抗购于源叶生物公司（批号：S20F10G81214）；胰蛋白酶购于吉诺生物医药技术有限公司（批号：1911150405）；实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒、Trizol、反转录试剂盒和T4 DNA Ligase均购于日本TaKaRa公司 （批号：RR086B、AA4502-1、AHE4572A、06114KA1）；放射免疫沉淀试验（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液购于上海基尔顿生物科技有限公司（批号：BYL40836）；四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-Tetramethylethylenediamine，TEMED）购于美国Amresco公司 （批号：00761）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购于赛国生物科技有限责任公司（批号：EZ2811F153）；端锚聚合酶2（tankyrase 2，TNKS2）、β-肌动蛋白（beta-actin，β-actin）、腺瘤样息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）一抗购于Abcam公司（批号：ab92329、ab8227、ab32197）；IRDye 800羊抗兔二抗和IRDye680羊抗鼠二抗购于Licor公司（批号：926-32211、926-68070）。

1.5 仪器 BX51型数码生物显微镜购于日本Olympus公司；Varioskan Flash多功能酶标仪为美国赛默飞公司产品；Mini－PROTEAN Tetra电泳系统、Mini Trans-Blot Electrophoretic槽式转印系统和qPCR仪均购于美国Bio-Rad公司；Odyssey双色红外激光成像系统购于美国Licor公司；5541R高速冷冻离心机购于德国Eppendorf公司。

1.6 方法

1.6.1 细胞培养 H125、H647、A549、PC9均采用含10% FBS的DMEM，于37℃、5% CO2的饱和湿度细胞培养箱中培养。

1.6.2 qPCR检测TNKS2表达 收集对数生长期的4种细胞，分别提取总RNA，逆转录为cDNA，反应条件为：95℃预变性30s，1个循环；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环；95℃ 10s，65℃ 60s，97℃ 1s，1个循环。采用公式2-ΔΔct计算基因相对表达量。所有引物由杭州有康生物技术有限公司设计并合成，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6.3 TNKS2小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰/过表达慢病毒构建包装及转染 基于美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站检索获得TNKS2全基因序列，合成TNKS2序列并设计短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）靶点序列，构建TNKS2干扰过表达慢病毒，设计和构建由赛澜生物技术（杭州）有限公司完成。将上述病毒感染对应细胞，获得稳定的NSCLC细胞株，再分别提取细胞内总RNA、总蛋白，鉴定干扰过表达效果。

1.6.4 含药血清制备 将所有药材以蒸馏水800mL浸泡30min，煎煮1h，将两次煎煮所得的药液混合浓缩，最终浓度为7.8g·mL-1[13]，即大鼠灌胃浓度。按照临床上成人等效剂量带入换算公式，计算出大鼠每日最大中药煎剂灌胃量为10.9g/（kg·d），以该剂量灌胃1周。末次灌胃1h后眼眶取血，室温静置4h，3 000r/min离心15min后分离血清，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，56℃水浴灭活30min，-80℃冰箱中冻存备用。

1.6.5 划痕实验 将细胞分为8组：A549+FBS组、A549+黄土汤含药血清组、A549 TNKS2+FBS组、A549 TNKS2+黄土汤含药血清组、H647+FBS组、H647+黄土汤含药血清组、H647 siRNA+FBS组、H647 siRNA+黄土汤含药血清组，其中A549+FBS组和H647+FBS组分别与1.6.1细胞培养中的A549和H647细胞相同处理。先用含10% FBS的完全培养基进行铺板，将各组细胞接种于6孔板内，培养6h后待细胞贴壁，换用无血清培养基培养过夜，分别于6孔板内进行划痕，PBS清洗2次，去除脱落细胞，再分别加入含黄土汤含药血清以及含FBS的完全培养基进行培养，最后在0、24h时镜下观察并拍照。细胞迁移能力以细胞迁移率表示，细胞迁移率 （%）=（0h划痕宽度-24h划痕宽度）/0h划痕宽度×100%。

1.6.6 Western blot法检测TNKS2蛋白和APC蛋白表达变化 将H647和A549细胞分为4组：黄土汤含药血清+H647 siRNA干扰组、H647 siRNA干扰组、黄土汤含药血清+A549过表达组、A549过表达组，其中H647 siRNA干扰组、A549过表达组以FBS培养，黄土汤含药血清+H647 siRNA干扰组、黄土汤含药血清+A549过表达组中加入黄土汤含药血清。各组培养48h后收获细胞并提取总蛋白，蛋白定量后电泳并转膜，用5%脱脂奶粉封闭90min，分别加入一抗（TNKS2稀释比例1:10 000、APC稀释比例1:5 000），4℃孵育过夜，含Tween20的Tris缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween20，TBST）漂洗3次，加入IRDye800羊抗兔二抗（稀释比例1:10 000）和IRDye680羊抗鼠二抗（稀释比例1:10 000）避光孵育90min。吸去二抗并洗净后以红外激光成像系统扫描，以Primer 6.0软件分析图像。以β-actin为内参，进行半定量检测，计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.01软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析及独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞筛选 qPCR结果提示，H647细胞TNKS2基因表达明显高于A549、H125、PC9细胞系（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），而A549、H125细胞系基因表达量较低，且两种细胞间基因表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。基于美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）的细胞背景调查发现，A549细胞系恶性程度低于H125，因此选择H647为本底TNKS2基因高表达细胞系，A549为本底TNKS2低表达细胞系，用于后续实验。

图1 各组细胞TNKS2表达比较Fig.1 Comparison of TNKS2 expression in each group

2.2 干扰/过表达慢病毒构建 通过NCBI基因数据库检索，基于PCR扩增技术对TNKS2全基因序列进行扩增，通过慢病毒载体构建pSLLV-CMV-TNKS2-puro质粒。见图2。通过TNKS2干扰靶点预测合成siRNA序列，构建pSLLV-U6-si TNKS2-puro质粒。见图3。通过感染293T细胞获得TNKS2基因过表达/干扰慢病毒，病毒滴度检测如表2。

表2 病毒滴度值及获取体积Tab.2 Virus titer value and acquisition volume

图2 慢病毒载体pSLLV-CMV-puroFig.2 Lentiviral vector pSLLV-CMV-puro

图3 慢病毒载体pSLLV-U6-puroFig.3 Lentiviral vector pSLLV-U6-puro

2.3 TNKS2过表达/干扰稳定转染细胞鉴定 以TNKS2干扰慢病毒转染H647细胞，构建TNKS2稳定干扰的细胞株；以TNKS2过表达慢病毒转染A549细胞，构建TNKS2稳定过表达的A549细胞株。提取细胞内总RNA和总蛋白，分别通过qPCR和Western blot进行鉴定。鉴定提示，与H647细胞比较，经siRNA-TNKS2干扰后H647细胞内TNKS2基因和蛋白表达明显降低（P＜0.001，P＜0.001），而且设定的2号siRNA干扰效果更佳。与A549细胞比较，经TNKS2过表达干预后A549细胞内TNKS2基因和蛋白表达明显升高（P＜0.001，P＜0.001）。见图4。

图4 TNKS2过表达/干扰稳定转染细胞鉴定Fig.4 Identification of TNKS2 overexpression/interference stable transfection cell

2.4 细胞迁移能力变化检测 黄土汤含药血清干预24h后，与A549+FBS组比较A549+黄土汤含药血清组细胞迁移率显著降低（P＜0.01）；经过TNKS2基因过表达干预后，A549 TNKS2+FBS组细胞迁移率有所上升（P＜0.05），经过TNKS2基因过表达和黄土汤含药血清联合干预后，细胞迁移率与A549 TNKS2+FBS组比较明显降低（P＜0.05）。见图5。黄土汤含药血清干预24h后，与H647+FBS组比较，H647+黄土汤含药血清组细胞迁移率明显降低（P＜0.001）；经过TNKS2干扰后，H647 siRNA+FBS组细胞迁移率同样降低（P＜0.01）；同时经过TNKS2干扰和黄土汤含药血清干预，H647 siRNA+黄土汤含药血清组细胞迁移率与H647 siRNA+FBS细胞组比较，进一步降低（P＜0.001）。见图6。

图5 A549细胞迁移能力变化（40×）Fig.5 Changes of cell migration ability of A549 cell（40×）

图6 H647细胞迁移能力变化（40×）Fig.6 Changes of cell migration ability of H647 cell（40×）

2.5 各组细胞TNKS2蛋白及APC蛋白表达比较 Western blot检测提示，黄土汤含药血清+H647 siRNA干扰组和H647 siRNA干扰组比较，两组TNKS2蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），但前者APC蛋白表达明显高于H647 siRNA干扰组，差异有统计学意义（P＜0.05）。黄土汤含药血清+A549过表达组和A549过表达组比较，前者TNKS2蛋白表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；但两组APC蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图7。

图7 各组细胞TNKS2蛋白及APC蛋白表达比较Fig.7 Comparison of TNKS2 protein and APC protein expression in each group

3 讨论

肿瘤转移是导致NSCLC患者病情恶化、死亡的主要原因。中医认为，正气不足、肺脾气虚是肺癌发生发展甚至扩散转移的重要病机[14]。根据这一病机，通过“培土生金”法健脾补肺已成为防治肺癌转移的重要方法之一[15]。本研究结果显示，基于培土生金理论的经方黄土汤，能够有效抑制NSCLC细胞的迁移能力，干预恶性化程度不同的NSCLC细胞转移进程，说明黄土汤对肺癌转移具有抑制作用。黄土汤立足于温中健脾，方中以灶心黄土（现用赤石脂）为君，温中止血；以白术、附子为臣，君臣相伍，温脾阳、补中气；佐以黄芩、生地、阿胶，清热滋阴养血，并遏制术、附辛温耗血之弊；最后以甘草调药和中为使。诸药配合，寒热并用，标本兼治，刚柔相济，温中健脾益肺。正如《石室秘录》所云：“治肺之法，正治甚难，当转治以脾，脾气有养，则土自生金。”[16]本研究结果在体外实验层面验证了黄土汤乃至培土生金法对肺癌发生和转移的影响。

研究发现，TNKS2在肿瘤细胞中表达升高[17]。A549、H125、PC9及H647这4种NSCLC细胞系的恶性程度依次增加，本研究发现上述细胞中TNKS2的表达也相应增加，说明TNKS2基因表达与NSCLC的恶性程度呈正相关。细胞划痕试验显示，恶性程度高的H647细胞迁移能力高于A549细胞。进一步实验发现，A549经过TNKS2基因过表达干预后，细胞迁移能力有所上升；而H647经过TNKS2干扰后，其迁移能力受到一定程度的抑制，表明TNKS2表达与NSCLC细胞迁移能力成正相关。经黄土汤含药血清干预后，A549、H647两种细胞的迁移能力均下降，经TNKS2基因过表达干预后的A549细胞和经TNKS2干扰后的H647细胞迁移能力亦下降，提示黄土汤对不同恶性程度NSCLC细胞迁移均有抑制作用。

有研究表明，TNKS2和Wnt信号通路相关蛋白APC、Axin以及β-catenin结合形成相应的复合物，从而影响癌症的发生、发展和转移[18-21]。APC是一种抑癌基因，其作用是增强降解复合体与β-catenin的亲和力[22]，通过参与Wnt信号通路，影响细胞的增殖与分化，是Wnt通路中的负向调节因子[23]。简而言之，TNKS2高表达与肺癌细胞恶性转化相关，而APC表达升高则能抑制肺癌转移进程。本研究中的Western blot结果提示，黄土汤能抑制经TNKS2基因过表达干预的A549细胞中TNKS2表达，能诱导经TNKS2基因干扰的H647细胞中APC表达升高，表明黄土汤对恶性程度不同的肺癌细胞均有干预作用，虽然其作用目标蛋白不同，但均与激活或抑制Wnt信号通路相关。因此，笔者推测黄土汤影响NSCLC细胞转移的机制与抑制细胞内TNKS2表达或促进抑癌蛋白APC表达有关。具体而言，恶性化程度低的NSCLC，其TNKS2表达低，黄土汤可能通过上调抑癌蛋白APC而起效；恶性化程度高的NSCLC，其TNKS2表达高，黄土汤则通过直接抑制TNKS2表达而起效。进一步推测，黄土汤可能毒副作用较低，在发挥良好治疗效果的同时，对患者机体正常细胞的杀伤力较弱。

综上所述，培土生金法对恶性程度不同的NSCLC细胞转移均有抑制作用，可通过下调TNKS2表达或通过诱导抑癌蛋白APC表达，从而干预与癌症发生、发展、转移密切相关的Wnt信号通路。但Wnt通路尚有多个调节蛋白参与，后续将锁定其他相关目标蛋白进行研究，以精准化研究培土生金法干预NSCLC的疗效靶点。