李品种(品系)果实中有机酸及VC含量的UPLC法测定

巫伟峰， 陈明杰， 陈国跃， 陈发兴

(1. 福建农林大学： a. 园艺学院， b. 海峡联合研究院 园艺植物生物学及代谢组学研究中心， 福建 福州 350002；2. 中国科学院庐山植物园， 江西 九江 332900； 3. 龙海市农业科学研究所， 福建 龙海 363100)

果实中有机酸和VC含量是评价果实品质的重要指标，目前多采用高效液相色谱(HPLC)法进行测定[1-2]，但随着色谱技术的快速迭代升级[3]，与HPLC法相比，超高效液相色谱(UPLC)法具有检测用时更短、色谱分离能力和分离度更高、溶剂消耗更少等优势，可达到化学成分精密检测的目的[4]。

李(PrunussalicinaLindl.)是传统水果之一，目前已采用HPLC法对其果实中有机酸和VC含量[5-8]进行了测定。为提高检测效率，探索更为灵敏的检测方法，作者以4个李品种(品系)果实为实验材料，采用UPLC法测定了7个有机酸成分及VC含量，以期为李果实品质检测和评价提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试的4个李品种(品系)为‘皇冠李’(‘Huangguan’)、‘黑琥珀李’(‘Blackamber’)、‘葡萄李’(‘Elodrao’)和‘西瓜李’(‘Xigua’)，均种植于福建省宁德市古田县。各品种(品系)分别选择3株健壮且无病虫害的植株，从树冠外围的东、南、西、北、中5个方位各选取形态和成熟度相近的果实5枚，用冰袋保存带回实验室，快速将果皮与果核分离；将中果皮切碎，混匀，经液氮速冻后置于-40 ℃冰箱中保存、备用。

主要仪器和试剂：ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(配有PDA eλ检测器，美国Waters公司)，Milli-Q Reference超纯水系统(美国Millipore公司)，Enppendorf 5810R离心机(德国Enppendorf公司)，KQ3200DA超声波清洗机(昆山舒美超声仪器有限公司)。苹果酸(批号09172)、柠檬酸(批号46933)、酒石酸(批号1643340)、琥珀酸(批号1623411)、富马酸(批号PHR1270)、草酸(批号41706)、乙酸(批号71251)和VC(批号47863)的标准品均购自美国Sigma公司，所有标准品纯度均为色谱纯及以上级别。

1.2 方法

1.2.1 UPLC色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm， 1.8 μm)，流动相为体积分数0.025%H3PO4溶液，流速0.2 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量1 μL。

1.2.2 标准曲线绘制 分别精密称取40.0 mg苹果酸、40.0 mg柠檬酸、20.0 mg酒石酸、100.0 mg琥珀酸、0.4 mg富马酸、4.0 mg草酸和4.0 mg VC标准品，同时吸取10.0 mg·mL-1乙酸标准品溶液10.0 mL，混合后用超纯水溶解并定容至100 mL，获得混合标准液(苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、草酸、VC和乙酸的质量浓度分别为0.400、0.400、0.200、1.000、0.004、0.040、0.040和1.000 mg·mL-1)，按1、5、10、50和100倍进行梯度稀释，0.22 μm滤膜过滤。按上述色谱条件测定各有机酸成分及VC标准品的峰面积，以峰面积为纵坐标(y)、各标准品质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线。

苹果酸标准曲线方程为y=12 422.78x+4 639.69(R2=0.999 97)，线性范围0.004 0～0.400 0 mg·mL-1；柠檬酸标准曲线方程为y=14 047.87x+933.01(R2=0.999 76)，线性范围0.004 0～0.400 0 mg·mL-1；酒石酸标准曲线方程为y=21 855.25x+3 901.52(R2=0.999 88)，线性范围0.002 0～0.200 0 mg·mL-1；琥珀酸标准曲线方程为y=12 587.65x+964.60(R2=0.999 89)，线性范围0.010 0～1.000 0 mg·mL-1；富马酸标准曲线方程为y=5 036 215.44x+717.37(R2=0.999 96)，线性范围0.000 0～0.004 0 mg·mL-1；草酸标准曲线方程为y=133 698.45x+1 318.27(R2=0.999 62)，线性范围0.000 4～0.040 0 mg·mL-1；乙酸标准曲线方程为y=16 566.22x+245.35(R2=0.999 99)，线性范围0.010 0～1.000 0 mg·mL-1；VC标准曲线方程为y=133 384.75x-1 101.82(R2=0.999 99)，线性范围0.000 4～0.040 0 mg·mL-1。

1.2.3 果实中有机酸和VC含量测定 精密称取各样品1 g，研磨至匀浆，加10 mL超纯水，室温超声(300 W)提取30 min，1 000 r·min-1常温离心10 min；取上清液，残渣用8 mL超纯水重复提取1次并离心；合并上清液，用超纯水定容至20 mL，0.22 μm滤膜过滤，按上述色谱条件进样测定，重复3次。根据峰面积和标准曲线计算样品中各有机酸成分和VC含量。

1.2.4 方法学考察 精密度考察：取‘葡萄李’果实提取液1 mL，按上述色谱条件重复进样测定5次，苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、草酸、乙酸和VC峰面积的RSD值分别为1.5%、1.1%、0.3%、0.8%、1.6%、0.2%、0.3%和0.4%，表明仪器精密度良好。

加样回收率考察：取‘葡萄李’果实提取液5 mL，加入5 mL稀释10倍的混合标准液，按上述色谱条件重复进样测定5次，计算加样回收率。苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、草酸、乙酸和VC加样回收率的RSD值分别为0.63%、1.73%、0.49%、0.14%、0.00%、0.57%、0.14%和0.58%，表明该测定方法准确度较高。

重复性考察：精密称取‘葡萄李’样品5份，按上述方法制备提取液，并按上述色谱条件进样测定。苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、草酸、乙酸和VC含量的RSD值分别为3.80%、1.43%、2.35%、5.57%、0.00%、4.25%、4.12%和2.13%，表明该测定方法重复性良好。

1.3 数据处理和分析

采用EXCEL 2019软件进行数据处理，采用SPSS 20.0软件进行ANOVA方差分析。

2 结果和分析

供试的4个李品种(品系)果实中有机酸成分和VC的含量见表1。结果显示：4个李品种(品系)果实中有机酸含量变幅较大，均以苹果酸含量最高(1.172 0～1.991 1 mg·g-1)，酒石酸含量次之(0.063 8～0.418 9 mg·g-1)，富马酸含量最低(0.000 1 mg·g-1以下)，柠檬酸、琥珀酸、草酸和乙酸含量为0.008 4～0.071 5 mg·g-1；有机酸总含量和VC含量变幅较小，分别为1.356 2～2.162 0和0.017 0～0.022 8 mg·g-1。

表1 李品种(品系)果实中有机酸成分与VC含量的比较

不同品种(品系)间，‘葡萄李’果实中苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸和VC的含量以及有机酸总含量总体上最低，但其琥珀酸和草酸含量则最高，且多数指标与其他品种(品系)存在显著(P<0.05)差异；‘黑琥珀李’果实中苹果酸和VC的含量以及有机酸总含量均最高，但其琥珀酸和乙酸含量则最低；‘西瓜李’果实中柠檬酸、酒石酸和乙酸的含量最高，但其草酸含量则最低；供试的4个品种(品系)中，以‘皇冠李’果实中各有机酸成分和VC的含量以及有机酸总含量较为均衡，处于中等偏高的水平。

3 讨论和结论

上述测定结果表明：采用UPLC法测定李果实中的苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、草酸、乙酸和VC含量，具有操作简便、重复性好的优点。

由测定结果可知：‘皇冠李’、‘黑琥珀李’、‘葡萄李’和‘西瓜李’果实均以苹果酸为主要有机酸成分，根据陈发兴等[9]划分的果实类型可将其归为苹果酸型果实。刘硕等[5]、王小红等[6]和李鹏等[10]的研究结果也显示其他李品种(品系)果实的有机酸成分也以苹果酸含量最高，可见不同品种(品系)李果实中有机酸的主要组成成分总体相似。供试的4个品种(品系)中，有机酸总含量和VC含量均以‘黑琥珀李’果实最高、‘葡萄李’果实最低，且‘皇冠李’、‘黑琥珀李’和‘西瓜李’果实间无显著差异，且以‘皇冠李’果实中各有机酸成分和VC的含量以及有机酸总含量较为均衡。供试的4个李品种(品系)果实中有机酸的组成比例存在明显差异，这种差异除与各品种本身的遗传特性有关外，还可能与种植地的气候和土壤因子以及栽培管理措施有关。

本文对4个李品种(品系)果实中有机酸和VC含量的测定结果可为筛选低酸、高VC含量的李品种(品系)提供依据，但本文仅涉及有机酸和VC含量，而果实中的可溶性糖含量、糖酸比和香气等指标也是评价果实品质的重要依据，因而，后期将进一步建立包含多项品质指标的多维评价体系，以期为建立李品种(品系)系统、全面的科学评价体系提供参考依据。