血浆SEPT9甲基化检测对结直肠癌诊断价值的临床研究

吴秀方，南琼，张晓红，耿婷，陈紫红

结直肠癌（CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内具有较高的发病率和死亡率，自20世纪90年代初以来，其在年轻人中的发病率几乎增加了1倍［1］。CRC早期的临床表现不典型，多数患者就诊时已错过了最佳手术时机，且发生远处转移患者的5年生存率仅为10%左右［2］，因此尽早发现结直肠的癌前病变和早期癌变并积极进行干预对降低CRC的病死率十分重要。

在先前的研究中已报道了几种基于DNA甲基化的CRC生物标志物，其中SEPT9甲基化（mSEPT9）被认为是检测CRC有前途的标志物之一［3］。SEPT9位于染色体17q25.3处，可编码在细胞代谢中发挥重要作用的SEPT9蛋白，而该蛋白能够防止细胞过快分裂或以不受控制的方式增殖，具有抑癌作用，当SEPT9启动子区域甲基化时，可阻止SEPT9蛋白表达，从而导致CRC的发生发展［4］。在CRC发生和发展过程中，mSEPT9 DNA从坏死性和凋亡性癌细胞释放到外周血中，因此，可以通过检测外周血SEPT9特定启动子区域的DNA甲基化程度来确定CRC发生风险。本研究检测了患者血浆mSEPT9与血清癌胚抗原（CEA），对二者在早期癌和进展期癌患者中的阳性率进行对比分析，并探讨了二者联合检测对CRC的诊断价值，以期寻找出一种能早期发现CRC的无创、简便、有效的检测方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017年12月—2018年12月在昆明医科大学第一附属医院消化内科、胃肠外科及肿瘤科就诊的患者272例。纳入标准：（1）于结肠镜检查前及术前采集血标本；（2）经结肠镜或术后病理检查确诊；（3）病历资料完整。排除标准：（1）妊娠期或哺乳期妇女；（2）合并其他恶性肿瘤或有恶性肿瘤病史者；（3）有放疗、化疗治疗史者；（4）有凝血功能障碍或血小板异常者；（5）检测中的无效样本。

1.2 样本量估算 已知阳性检出率公式用于样本量估计：N=Z2×〔P（1-P）〕/E2。Z是一个统计参数（对于95%CI，Z=1.96），E代表误差（在本研究中选择0.1），P代表假定的阳性检出率。本研究P代表SEPT9基因甲基化试剂盒对CRC的已知灵敏度，从先前的一项初步研究中获得。如果已知灵敏度等于0.75，则至少需要72个CRC病例。本研究中纳入CRC患者126例（早期癌72例、进展期癌54例）。

1.3 分组标准 以结肠镜检查及术后病理检查结果作为金标准，对照组：结肠镜检查提示结直肠黏膜正常；腺瘤组：结肠镜下息肉切除术后病理检查结果提示管状腺瘤、管状-绒毛状腺瘤；早期癌组：指癌变组织局限于黏膜层及黏膜下层，病理类型包括高级别上皮内瘤变、黏膜内癌、黏膜下癌；进展期癌组：病变侵及固有肌层及以下或发生远处转移。

1.4 分组 对照组82例，其中男47例、女35例，平均年龄（57.7±9.2）岁；腺瘤组64例，其中男37例、女27例，平均年龄（56.8±12.4）岁；早期癌组72例，其中男41例、女31例，平均年龄（56.1±12.3）岁；进展期癌组54例，其中男31例、女23例，平均年龄（58.1±12.6）岁。

1.5 血浆mSEPT9检测和血清CEA检测 采用SEPT9基因甲基化试剂盒（北京博尔诚科技有限公司）检测血浆mSEPT9，按照试剂盒说明书进行血浆DNA提取、亚硫酸盐转化处理和PCR反应。试剂盒中提供了阳性和阴性对照，每一次检测需要同时检测阴、阳性对照。血清CEA检测由昆明医科大学第一附属医院检验科采用电化学发光法完成，参考值为5 ng/ml，血清CEA高于参考值为阳性。

1.6 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件包进行数据处理和统计学分析。呈正态分布的计量资料以（±s）表示；计数资料以相对数表示，采用χ2检验；绘制血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测诊断CRC的四格表，并分析其对CRC的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床特征CRC患者血浆mSEPT9阳性率不同年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤最大直径CRC患者mSEPT9阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；早期癌患者血浆mSEPT9阳性率低于进展期癌患者，有淋巴结转移患者血浆mSEPT9阳性率高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.001，见表1）。

表1 不同临床特征CRC患者血浆mSEPT9阳性率比较〔n（%），n=126〕Table 1 The relationship between mSEPT9 positive rate and different clinical characteristics of CRC patients

2.2 对照组、腺瘤组、早期癌组、进展期癌组患者血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测的阳性率比较 对照组、腺瘤组、早期癌组和进展期癌组患者血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测的阳性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）。早期癌组和进展期癌组血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测的阳性率均高于对照组和腺癌组（P＜0.05）；进展期癌组血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测的阳性率高于早期癌组（P＜0.05）；对照组和腺瘤组各指标检测阳性率间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

表2 对照组、腺瘤组、早期癌组、进展期癌组患者血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测结果分析〔n（%）〕Table 2 Results analysis of plasma mSEPT9，serum CEA and both in control group，adenoma group，early stage cancer group and progressing stage cancer group

2.3 血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测结果分析 血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测与金标准检测结果见表3。血浆mSEPT9及血清CEA联合检测的灵敏度、准确度、阴性预测值高于单一指标检测，血浆mSEPT9联合血清CEA检测与金标准诊断一致性检验，Kappa值为0.514（见表4）。

表3 血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测对CRC的诊断结果（例）Table 3 Results analysis of plasma mSEPT9，serum CEA and the combination of the two compared to the gold standard

表4 血浆mSEPT9、血清CEA及二者联合检测对CRC的诊断价值Table 4 Diagnostic value of mSEPT9，serum CEA and their combined test for CRC

3 讨论

本研究发现血浆mSEPT9的阳性率与CRC患者的年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤最大直径无关，与既往研究结果相似［5-6］。临床上男性CRC的发病率高于女性，但本研究结果显示mSEPT9检测的阳性率在男性和女性之间没有差异，表明两性共享相似的SEPT9基因甲基化谱，而且CRC的发病机制也可能相似，男女患者均可以使用血浆mSEPT9诊断CRC。在CRC的发病部位中，结肠癌多于直肠癌［7］，但本研究显示血浆mSEPT9阳性率在结肠和直肠之间没有明显差异，表明这两个部位的肿瘤具有相似的发病机制，这一优势对于从结肠和直肠中检出病变至关重要，因为假如肠道准备不充分或患者不耐受，结肠镜检查可能会漏诊一部分回肠末端和升结肠的癌症，而粪便沿结肠运动时血红蛋白降解，导致右侧结肠粪便免疫化学测试（FIT）的检出率低于左侧结肠［8］，因此，结肠镜和FIT在检测右半结肠癌方面均显示出不足，但采用血浆mSEPT9检测则可在不同结直肠部位有效检出CRC，这有助于其在CRC筛查中的应用。目前仍需要多中心、大样本的数据进一步验证血浆mSEPT9水平与肿瘤最大直径的关系。

本研究显示，对照组和腺瘤组患者血浆mSEPT9阳性率无明显差异，提示该检测不能有效鉴别出腺瘤患者。CHURCH等［9］进行的前瞻性研究显示，血浆mSEPT9对晚期腺瘤的灵敏度仅为11.2%。考虑腺瘤检出率较低是标志物向血液中释放存在差异所致。本研究显示，早期癌组患者血浆mSEPT9阳性率高于对照组，但其阳性率仅为33.3%，临床意义较小，这限制了其对早期CRC和癌前病变（腺瘤）的鉴别能力。

本研究显示，血浆mSEPT9患者的阳性率与肿瘤分期、有无淋巴结转移有关。XIE等［10］的研究也显示，血浆mSEPT9检测对Ⅲ期和Ⅳ期患者的诊断灵敏度高于0期和I期患者，对有淋巴结转移患者的诊断灵敏度高达85.71%。因此，与早期CRC患者相比，晚期CRC患者更容易检测出血浆mSEPT9。分析早期CRC患者的血浆mSEPT9阳性率低的原因可能是早期CRC病灶通常较小，侵入性较小，将异常血浆mSEPT9 DNA释放到血液中的机会较小。

血浆mSEPT9在CRC检测中的诊断灵敏度在已发表的文献中有所不同，对欧美人群的灵敏度为58%～95.6%，对亚洲人群的灵敏度为69%～88%［11-13］。本研究血浆mSEPT9检测诊断CRC的灵敏度为57.14%，特异度为86.99%，灵敏度低于文献报道，其可能由于以下几个原因导致：首先，血浆mSEPT9检测的阳性率与恶性程度呈正相关，晚期CRC患者血浆mSEPT9检测阳性率高于早期CRC患者［14］，本研究纳入了较多的早期癌患者（72/126），因此灵敏度较其他文献报道偏低；其次，与目前大部分研究采用的Epi proColon2.0试剂盒不同，本研究采用的是国产简化试剂盒，将PCR反应次数从2～3次简化成1次，降低了检测成本，且可减少算法对研究结果的影响，而张春燕等［15］采用同样的试剂盒并以Ct值≤41.00为阈值，灵敏度为62.5%，特异度可高达90.0%，考虑可能与受检者存在地区差异有关；最后，LEE等［16］发现韩国人群中血浆mSEPT9诊断CRC的灵敏度非常低，仅为36.6%，因此灵敏度差异可能部分归因于人口统计学特征（性别、种族和年龄）、生活方式（吸烟和饮酒）、合并症或其他环境暴露因素引起的样本异质性。

本研究结果显示，早期癌组患者血浆mSEPT9和血清CEA检测的阳性率分别为33.3%和16.7%，二者联合检测的阳性率可提高至41.7%；进展期癌组患者血浆mSEPT9和血清CEA检测的阳性率分别为88.9%和55.6%，二者联合检测的阳性率可达到100.0%。余南荣等［17］研究显示CRC患者血浆mSEPT9联合血清CEA检测的阳性率为82.9%，较单独血清CEA检测的阳性率明显升高。因此，联合诊断在早期癌中和进展期癌中灵敏度均可进一步提高，这在早期癌筛查中有重要临床意义，并为将来的CRC筛查提供了一种新方法，但仍需要扩大样本量进行进一步研究。

综上所述，血浆mSEPT9检测单独应用于鉴别腺瘤和早期癌价值有限，在早期和进展期CRC患者中，血浆mSEPT9检测阳性率均高于血清CEA，二者联合检测的诊断价值可进一步提高，这在早期CRC筛查中有重要临床意义。

作者贡献：吴秀方进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，统计学处理，结果的分析与解释，撰写并修订论文，对文章整体负责，监督管理；吴秀方、张晓红、耿婷、陈紫红进行数据收集、整理；南琼负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。

本研究局限性：

血浆SEPT9甲基化（mSEPT9）检测在进展期结直肠癌（CRC）患者中的阳性率高达88.9%，明显高于血清癌胚抗原（CEA） 55.6%的阳性率，但其是否可能作为CRC疗效评估和术后监测的指标还有待进一步研究。本研究对象并非均是无症状的平均风险人群。因此，在最终应用该检测的前瞻性筛查环境中，其性能评估可能会有很大差异。一些重要的参数（例如患者依从性或成本效益）无法在本研究中进行评估。本研究选取的是2017—2018年的病例，研究结果可能存在局限性。