沙棘原花青素测定方法学考察及含量测定

田建华

(1.山西省林业和草原科学研究院，山西 太原 030012；2.国家林草沙棘工程技术研究中心，山西 太原 030012)

沙棘是一种药食同源植物。沙棘果实富含天然维生素、油脂、脂肪酸、有机酸、黄酮类化合物、原花青素等多种生物活性物质，在医药、化妆品和保健品等领域具有广泛的用途。其中，原花青素的抗氧化活性极强，在人体内抗氧化和清除自由基的能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，还具有保护血管、抗肿瘤及美容的作用。目前，常见的原花青素提取物多源于葡萄籽。刘朵花等研究表明，沙棘籽可能是更好的原花青素来源。张素华等分析测定表明，沙棘籽壳含有原花青素，且含量较高。目前，未见对沙棘原花青素测定方法评价的文献，笔者采用原花青素测定的国标方法，用于沙棘原花青素的测定并进行方法学考察，旨在确定适用于沙棘原花青素含量的测定方法，为建立和完善沙棘原花青素的质量标准体系提供可靠的方法和试验依据。

1 材料与仪器

试验材料包括沙棘籽(购自山西省某沙棘饮料厂)、原花青素标准品(成都曼斯特生物科技有限公司)、HPLC≥95%(成都曼斯特生物科技有限公司)、甲醇、正丁醇、盐酸、硫酸铁铵。

试验仪器有JYL-C020E粉碎机(九阳股份有限公司)、Explorer pro分析天平(奥豪斯仪器有限公司)、SCIENTZ-12N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)、HH数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司)、KQ-200VD型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、UV3100PC紫外-可见分光光度计(美普达仪器有限公司)、SC-3610低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

2 试验方法

2.1 材料预处理

将沙棘籽、籽壳、籽渣分别进行真空冷冻干燥，然后粉碎、过筛，备用。

2.2 原花青素标准曲线的绘制

精密称定原花青素标准品10 mg于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，溶液现用现配。准确量取原花青素储备液0.00 mL，0.10 mL，0.25 mL，0.50 mL，1.00 mL，1.50 mL，2.00 mL，2.50 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得原花青素标准系列工作溶液。

准确吸取原花青素标准系列工作液各1 mL，置于安瓿瓶中，加入盐酸-正丁醇溶液6 mL，硫酸铁铵溶液0.2 mL，混匀，用封口钳将其密封，置沸水中加热40 min后，取出，立即置于冰水中冷却至室温，于546 nm波长处测吸光度。以吸光度为纵坐标，原花青素浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取沙棘籽样品约50 mg于50 mL容量瓶中，加入甲醇，超声处理20 min，冷却至室温。离心，过滤，回收滤液，残渣用甲醇洗涤，洗液并入容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得供试品溶液。

2.4 重复性试验

精密量取250 μL供试品溶液6份，加入750 μL甲醇于安瓿瓶中，按照标准曲线绘制方法操作，以相应试剂为空白。于546 nm波长处测定供试品溶液的吸光度，按标准曲线计算样品中原花青素含量，计算相对标准偏差。

2.5 稳定性试验

精密量取250 μL供试品溶液，加入750 μL甲醇于安瓿瓶中，按照标准曲线绘制方法操作，以相应试剂为空白。分别于0 min，10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，60 min，70 min，1 000 min时，测定其在546 nm波长处的吸光度。按标准曲线计算样品中原花青素含量，计算相对标准偏差。

2.6 加标回收率试验

取已知原花青素含量的沙棘籽样品1份，按照供试品溶液制备方法操作。将供试品溶液分为3组，每组3份，置于安瓿瓶中，分别加入相当于样品量80%，100%，120%的标准品，用甲醇溶解，按照标准曲线绘制方法操作，以相应试剂为空白。于546 nm波长处测定吸光度，计算样品的加标回收率及相对标准偏差。

2.7 原花青素含量测定

按2.3所述方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液1 mL，置于安瓿瓶中，然后按照标准曲线制作步骤执行，以相应试剂为空白。测定样品吸光度，计算样品中原花青素的含量。计算公式如下：

式中：X——试样中原花青素的含量，%；

c——混合物中原花青素的浓度，μg/mL；

V——待测样液总体积，mL；

V1——样液反应体积，mL；

V2——样液反应后总体积，mL；

m——样液所代表的试样质量，mg.

3 结果与分析

3.1 原花青素标准曲线

按2.2所述方法，绘制原花青素标准曲线，见图1.

图1 原花青素标准曲线

由图1可见，用最小二乘法得到回归方程为y=0.004 7x-0.030 1，其相关系数R2=0.992 7.表明样品浓度在25 μg/mL～250 μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

3.2 重复性试验

重复性试验中，6份供试品溶液的原花青素含量测定结果见第13页表1.

由表1可知，样品中原花青素平均含量为48.12%，RSD值为2.80%(n=6)，表明该方法具有良好的重复性。

3.3 稳定性试验

稳定性试验中，10个时间处理下的吸光度测定结果见表2.

表1 重复性试验测定结果 %

表2 稳定性试验测定结果

表2结果表明，在70 min内吸光度(A)值保持稳定。经过约16.7 h，测定吸光度值略有下降。因此，显色后应在70 min内测定吸光度。

3.4 加标回收率试验

加标回收率试验中，9个处理的测定结果见表3.

表3 加标回收试验测定结果

由表3可见，3种不同标准品量的原花青素平均回收率分别为95.73%，100.45%，103.21%，均在95%～105%之间，且RSD值均小于2%.表明该方法在系统误差范围内，可以作为原花青素含量的测定方法。

3.5 沙棘样品中原花青素含量

不同沙棘样品中原花青素的含量的测定结果见表4.

表4 不同沙棘样品中原花青素的含量 %

由表4可知，沙棘籽中原花青素的平均含量为45.62%，脱脂籽渣的原花青素平均含量为8.15%，沙棘籽壳中原花青素的平均含量最高，达到66.01%，与前人报道的结果一致。

4 结论与讨论

原花青素的测定原理是在加热的酸性条件和铁盐催化作用下，C-C键断裂而生成深红色花青素离子。常见的分析检测方法有分光光度法和高效液相色谱(HPLC)法，目前正丁醇-盐酸-HPLC法是原花青素测定的国标方法，但检测成本相对较高。本试验采用紫外分光光度法测定原花青素的含量，方法学考察显示该方法重复性(RSD=2.80%)和稳定性(RSD=0.24%)好，回收率(RSD<2%)高，操作简单方便，且检测成本较低。用该方法测得沙棘籽和沙棘籽壳中原花青素平均含量分别为45.62%和66.01%，该方法可进一步应用到实验室内部或企业日常质量控制等场合。