超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品16种兽药残留量的研究*

陈鑫

（福州市产品质量检验所，福建 福州 350025）

近年来，兽药在养殖业、畜牧业中的应用日趋广泛，但是，由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，一些养殖户在养殖过程中存在超剂量、违禁、不遵守休药期等使用兽药的问题，导致动物源性食品中兽药残留成为了日益突出的问题。目前，动物源性食品中常见有抗病毒类、磺胺类、喹诺酮类、抗生素类、激素类、镇静剂等兽药残留，由于动物源性食品种类繁多，样品基质复杂，检测目标物种类和组分多，理化性质差异大，是兽药残留分析检测技术的重大难题。我国测定动物源性食品中兽药残留的国家标准[1～3]大部分都是分类检测为主，一个样本要进行多次检验，需要耗费极大的人为、物力、财力和时间。针对动物源性食品兽药残留检验任务繁重且时间紧迫的问题，研究快速、有效的分析检测方法，提高提取和净化效率，提高检测灵敏度，建立高通量的多兽药残留分析方法是当前兽药检测研究的方向。

本研究依据国家食品安全监督抽检实施细则（2020版）[4]动物源性食品中喹诺酮类、磺胺类限用兽药监测项目，结合抗病毒类禁用药物，建立同时检测动物源性食品中抗病毒类、喹诺酮类、磺胺类（金刚烷胺、金刚乙胺、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶）16种禁限用兽药残留的高效液相色谱－串联质谱检测方法，为提高禁限用兽药残留检测效率，保障食品安全提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鸡肉、鸡肝、猪肉和猪肝样品均为市售。

1.1.2 试剂及耗材

标准品（金刚烷胺、金刚乙胺：ChromaDEX公司；恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶：农业部环科所）。

氘代内标（金刚烷胺D6、金刚乙胺D4 ：Cndisotopes公司；恩诺沙星D5、环丙沙星D8、诺氟沙星D5、磺胺间二甲氧嘧啶D6、磺胺邻二甲氧嘧啶D3：农业部农产品质量标准研究中心）。

净化填料（C18、PSA：安捷伦科技有限公司；NH2、Florisil：Agela科技有限公司）。

试剂（水为超纯水；甲醇、乙腈、乙酸铵、无水硫酸镁、无水硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器

1290 超高效液相+6460A质谱仪：美国Agilent公司；

InertSustain C18 柱：2.1 mm×50 mm，2 μm，日本岛津公司；

Eclipse XDB-C8 柱：2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美国安捷伦科技有限公司；

KQ3200B 型超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；

N-EVAP氮吹浓缩仪：美国Organomation公司； GENIUS 3 旋涡混合器：德国IKA公司；

TDL-5-A 低速台式离心机：上海安亭电子仪器厂； AL204 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相条件

色谱柱：C18色谱柱，2.1 mm（内径）×50 mm，粒径 2μm；流动相：A，含0.1%甲酸的水溶液，B，乙腈。

柱温： 35 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：1 μL。 梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序表

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾ESI，正离子模式；扫描方式：多反应监测MRM；雾化气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气。

使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，监测离子对、碰撞能以及碎裂电压等主要质谱参数见表2。

内标法定量，金刚烷胺以金刚烷胺D6为内标；金刚乙胺以金刚乙胺D4为内标；恩诺沙星以恩诺沙星D5为内标；环丙沙星以环丙沙星D8为内标；诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星以诺氟沙星D5为内标；磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉以磺胺间二甲氧嘧啶D6为内标；磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶以磺胺邻二甲氧嘧啶D3为内标[2,3]。

1.4 标准溶液配制

标准溶液的配制：分别取适量标准品，用甲醇分别配制成10.0μg/mL的标准储备液，避光-18 ℃下保存，有效期3个月。用甲醇将标准储备液稀释，配成磺胺类、氟喹诺酮类浓度为1.0μg/mL，抗病毒类浓度为0.1μg/mL的混合标准中间溶液，避光-18 ℃下保存，有效期1个月。

表2 目标化合物质谱参数

内标溶液的配制：分别取适量氘代内标，用甲醇分别配制成10.0μg/mL的标准贮备液，避光-18 ℃下保存，有效期3个月。用甲醇将内标储备液稀释，配成磺胺类、氟喹诺酮类浓度为1.0μg/mL，抗病毒类浓度为0.1 μg/mL的混合内标标准中间溶液，避光-18 ℃下保存，有效期1个月。

混合标准工作溶液：吸取适量的混合标准中间溶液和同位素内标中间溶液，用甲醇配制成磺胺类、氟喹诺酮类浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL（混合同位素内标浓度为10.0 ng/mL)，抗病毒类浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL（混合同位素内标为1.0 ng/mL）的混合标准工作溶液，当天配制。

1.5 实验方法

称取约5.00 g（精确至0.01 g）的均匀试样，置于50 mL塑料离心管中，准确加入混合内标工作液10μL，加入1 g氯化钠，15 mL 1%甲酸-乙腈溶液（体积分数），涡旋混合30 s，超声提取10 min，4000 r/min离心5 min，收集上清液。剩余部分重新加入15 mL 1%甲酸乙腈，重复提取1次，合并2次提取有机相，待净化。

净化：将提取液移入含有100 mg C18填料和500 mg 无水硫酸钠的试管中，涡旋提取30 s，吸取所有有机相溶液，50 ℃氮吹浓缩至近干，加入1.0 mL0.1%甲酸-25%乙腈水，涡旋混合溶解残渣， 0.22μm滤膜过滤后进行液相色谱串联质谱测定[5,6]。

2 结果与分析

2.1 质谱和色谱条件的优化

图1 色谱柱分离效果图

对目标化合物的质谱及色谱条件进行了优化，目标化合物及其内标物的定量离子色谱图及质谱参数结果见图2和表2。比较了C18和C8色谱柱对目标物的分离效果，C8色谱柱对目标物的保留能力均较弱，峰形较宽，选用C18色谱柱作为分离色谱柱。比较了几种不同流动相体系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.01 mol/L乙酸铵、甲醇-0.01 mol/L乙酸铵），经比较发现，当水相中含有甲酸时，能够明显提高色谱分离的效果；使用乙腈为有机相时，各化合物的峰形和灵敏度效果优于甲醇，最终选用乙腈-0.1%甲酸水为流动相，液相色谱梯度洗脱程序如表1所示，标准物质色谱柱分离效果如图1所示。

2.2 前处理条件的优化

本研究选择猪肉作为实验对象，分别用乙腈、1%甲酸-乙腈（体积分数）、1%乙酸-乙腈（体积分数）、1%氨水-乙腈（体积分数）4种提取溶液，通过添加回收实验发现，1%甲酸-乙腈（体积分数）提取溶液的提取效果优于其它提取溶液，其回收率最好。因此，本研究选择1%甲酸-乙腈体系作为提取溶液体系。

QuEChERs 净化方法所使用的填料有PSA、C18、GCB、NH2和Florisil等，本研究首先考察了这几种填料对目标化合物的净化效果，分别在标准工作液中加入50 mg填料，结果表明， GCB、NH2、Florisil对氟喹诺酮类化合物及磺胺氯哒嗪有不同程度上的吸附，PSA对磺胺氯哒嗪有吸附，只有C18吸附剂不干扰目标化合物的响应值。进一步考察C18填料使用量，最终选择C18 100 mg作为净化吸附剂。

图2 目标化合物定量离子提取色谱图

图2 目标化合物定量离子提取色谱图（续）

2.3 定量方法选择

基质效应影响主要是指基质在电离源雾化电离过程中对目标物的雾化电离产生抑制或增强作用[7]。通常，去除基质效应的方法是配制基质加标曲线，但由于检测样品种类繁多，难以找到匹配基质液。因此，本研究采用同位素内标法，通过内标定量，降低样品处理过程中基质产生的影响。

分别考察了纯标准物质线性、基质空白加标线性（将空白样品按前处理方法提取净化后，在提取液中添加目标化合物配制成系列标准曲线）、随行加标线性（空白样品，加入一定量的标准溶液，与样品同时进行提取和净化得到的线性），经比较发现：随行加标线性由于在提取和净化过程中造成了损失，得到的线性不够理想；纯标准物质线性、基质空白加标线性由于内标校正作用，其线性及对目标化合物的定量效果相当，考虑到基质空白加标线性配制过程繁琐，因此，采用纯标准物质线性进行定量，线性方程及相关系数见表3。

2.4 方法的检出限、回收率和精密度

分别进行了猪肉、猪肝、鸡肉和鸡肝样品的基质加标实验，以3倍信噪比，进行检出限的考察，综合不同基质的复杂性，得出抗病毒类药物金刚烷胺和金刚乙胺的最低检测限均为0.5μg/kg，磺胺类和氟喹诺酮类药物的最低检测限为1.0μg/kg。采用添加回收的方法进行回收率实验，添加了3个不同水平，每个试验对象进行6次平行试验，计算其标准偏差。通过表4和表5可知，本方法的回收率范围为71.2%～119.6%，相对标准偏差范围为1.8%～10%，能满足兽药残留测定的要求。

表3 线性方程、相关系数

表4 抗病毒类药物回收率和精密度

表5 磺胺类和氟喹诺酮类药物回收率和精密度

图3 阳性样品色谱图

2.5 样品检测

采用所建立的方法测定了购于超市及农副产品市场样品，测定鸡肉、鸡肝、猪肉和猪肝样品共计38份，所检测样品检出2份恩诺沙星及1份氧氟沙星药物残留，阳性样品色谱图见图3。

3 结论

本研究建立了动物源性食品中16种禁限用兽药残留的分析方法，通过优化液相色谱、质谱条件，考察样品前处理方法，内标法定量，建立了动物源性食品中抗毒类、磺胺类和氟喹诺酮类16种兽药残留的液相色谱串联质谱法测定方法。该方法操作简单、快速、准确，克服单一种类兽药残留检验操作繁琐的缺点，适用于多兽残实际样品的筛查和测定。