水稻籽粒厚度基因GT1的连锁分析

李陛方

（蕉岭县长潭镇农业农村服务中心，广东 梅州 514185）

水稻是中国的第一大粮食作物，随着我国人口的不断增长，预计到2030年，我国粮食总量将要从2010年的5.8亿吨增至7.4亿吨方能满足需要[1-2]，因此，提高水稻产量对我国的粮食安全具有重要的意义。

影响水稻产量最重要的因素之一是水稻的籽粒性状，包括粒重、粒长、粒宽、粒厚和长宽比等，而且水稻籽粒性状已成为水稻高产优质分子设计育种的重要靶标性状[3]。其中粒厚是水稻籽粒性状的重要组成部分，是水稻重要的经济性状。熊振民和孔繁林通过对籼稻的9个杂交组合进行研究，发现水稻的籽粒性状中粒厚与粒重的关系最为密切，粒厚是受多基因控制的粒形性状[4]。水稻粒厚性状的遗传机制较为复杂，同时国内外学者对水稻粒厚性状的遗传研究报道也较为少见，因此有必要对水稻粒厚性状进行适当的研究。

经多年观察，水稻的粒厚性状与巨胚性状可能存在连锁遗传，本研究通过调查分析表现型为厚粒正常胚的水稻品种XHZ和表现型为薄粒巨胚的水稻品种JPHN两亲本杂交后代F2群体的田间表现，证明巨胚性状与粒厚性状的连锁关系，然后利用巨胚基因GE附近的一些分子标记引物对两个亲本进行多态性标记筛选，尝试对粒厚基因GT1作进一步的定位分析。通过定位粒厚基因，寻找控制粒厚的关键基因，为今后开展进一步的粒厚基因精细定位、克隆和功能分析，对阐明水稻籽粒性状遗传控制和产量形成的机理，具有重要的研究意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

两个水稻品种：XHZ和JPHN为亲本材料。XHZ是水稻品种新黄占，该品种的籽粒为厚粒，胚为正常胚；JPHN是水稻品种巨胚黑糯，该品种的籽粒为薄粒，胚为巨胚。

1.2 方法

1.2.1 提取亲本DNA进行多态性标记筛选

预计巨胚性状与粒厚性状连锁，在巨胚基因附近设计了9对分子标记物在两亲本间进行多态性标记筛选。9对分子标记的引物序列以及片段大小见表1。

表1 用于两亲本间多态性筛选的分子标记

1.2.2 提取DNA并进行PCR扩增

提取两个亲本材料XHZ和JPHN的DNA，然后，使用适当的引物分别对其进行PCR扩增。运行反应的程序为：95℃变性4 min，循环（95℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃适温延伸 40 s），一共 40 个循环，72℃延伸10 min，最后 15℃保存[5]。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，观察电泳图谱的成像结果，拍照分析并保存。

1.2.4 田间种植

利用这两个品种XHZ和JPHN进行杂交得到其亲本及F1代杂交种子。进行筛选工作剔除假杂种，播种F2代种子，后进行插秧工作，田间种植26行，以数字编号1～26，每行40株，以数字编号1～40，插秧时确保单本插秧。统一栽培管理，保持田间肥水一致，得到F2代群体约1 000株。水稻成熟时，在约1 000株系中每个株系随机收获3穗，自然晾干后进行考种工作。

1.2.5 巨胚的观察与统计

在每个样本中，随机选取5粒完整无损的稻谷，剥去稻壳，露出完好的稻米籽粒，观察胚的大小，记录出现巨胚的样本。

1.2.6 粒厚的测定

水稻籽粒厚度的测定标准参照《水稻种质资源描述规范和数据标准》[6]。实验方法：随机数取完整无损的10粒稻谷，将稻谷肩并肩侧竖于胶带上，使其不倾斜，不留缝，测出厚度，每份材料重复测量2次，取其平均值即为粒厚。

1.2.7 数据分析

利用Excel软件计算水稻粒厚的均值，统计F2群体中厚粒正常胚、薄粒巨胚、厚粒正常胚和厚粒巨胚四种表现型的样本数目，观察其频率分布并计算重组率，判断粒厚与巨胚之间是否存在连锁。

2 结果与分析

2.1 亲本的表型分析

测量两亲本的粒厚，并观察其胚型。两亲本的表型情况见表2。亲本XHZ的粒厚性状表现为厚粒，胚的性状表现为正常胚；亲本JPHN的粒厚性状表现为薄粒，胚的性状表现为巨胚。

表2 两亲本的表现型

2.2 巨胚与粒厚的连锁分析

F2群体四种表现型的分离情况如表3所示。在F2群体中，厚粒正常胚和薄粒巨胚为亲本型，薄粒正常胚和巨胚为重组型，根据重组率的计算公式：重组率（%）=（重组型个体数/测交子代的个体总数）×100%，可以计算出F2群体1～8、9～16、17～26及总群体1～26的重组率分别为25.60%、24.40%、28.50%和26.40%。因此，可以知道控制巨胚的基因与控制粒厚的基因存在连锁关系。粒厚与巨胚两个基因之间的重组率为26.40%，连锁距离为26.40 cm。

表3 F2群体各表型的分离情况及重组率

2.3 亲本间多态性标记筛选

因为水稻巨胚基因GE与粒厚基因GT1是连锁的，在巨胚基因GE附近找到这9对分子标记引物：GT01、GT02、GT03、PSM353、RM505、PSM432、RM234、RM18 和RM47，对两个亲本XHZ和JPHN进行多态性分子标记筛选，结果显示并未能利用这9对分子标记引物筛选到两者存在多态性，因此无法对粒厚基因进行进一步的定位分析。

3 结论

本研究对XHZ和JPHN两个亲本杂交后代F2群体四种表型，即厚粒正常胚、薄粒巨胚、薄粒正常胚和厚粒巨胚的分离情况进行统计分析后发现，水稻籽粒厚度基因与巨胚基因是连锁的，根据重组率计算公式可以计算出两个基因之间的重组率为26.40%，连锁距离为26.40 cm。

本研究通过统计分析XHZ和JPHN杂交后代F2四种表型的分离情况，验证了水稻巨胚基因与籽粒厚度基因的连锁关系，然后利用了巨胚基因GE附近的9对分子 标 记 引 物 ：GT01、GT02、GT03、PSM353、RM505、PSM432、RM234、RM18和RM47，试图使用这些引物在两个亲本XHZ和JPHN之间进行多态性分子标记筛选，尝试对水稻籽粒厚度基因作进一步的基因定位。然而在实际操作中，未能成功地利用这9对分子标记引物筛选出两个亲本的多态性，无法进行下一步的粒厚基因定位。因此，今后应使用更多的分子标记引物去进行它们的多态性分子标记筛选，完成水稻籽粒厚度基因的定位分析。对粒厚基因进行定位分析，可以帮助了解水稻产量性状的分子调节机制，同时也可以在生产实践中提高水稻产量提供更多的利用途径。随着更多的水稻籽粒性状相关基因的定位、QTL克隆和相关功能研究，将会更加了解水稻籽粒性状控制的分子机制，掌握水稻产量性状复杂的遗传机理，为水稻高产分子育种提供相应的理论依据，并在水稻分子育种的实践中得到应用。