天津某牧场奶牛乳房炎奶样与环境中细菌的分离与鉴定

胡海燕 刘慧敏 孟 璐 郑 楠 王加启 程建波

(1．安徽农业大学 动物科技学院，合肥 230000；2.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所/农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室(北京)，北京 100193；3．中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

乳房炎是奶牛的重要疾病之一，会造成产奶量与乳品质(脂肪、蛋白质、乳糖等)下降[1-2,6]和奶牛寿命减少甚至死亡[3]，影响牧场经济效益[4]和奶牛福利影响[5]。致病菌感染是奶牛乳房炎患病最主要的原因，总共有100多种微生物可引起乳房炎，这些微生物可分为常见致病菌(包括主要和次要致病菌)以及非常见致病菌。常见致病菌约有20多种，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)等[7]。在奶牛场的大罐乳[8]或单独挤奶的乳房炎奶样[9]中，均可检测到Sta.aureus、Str.agalactiae和停乳链球菌(Str.dysgalactiae)等不同的致病菌。环境是乳及乳制品中细菌或引起奶牛乳房炎的致病菌的来源之一。在研究生乳和牛场环境分离的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的流行性和遗传多样性时，从生乳以及环境样品中总共检测到B.cereus菌株56种，并使用多位点序列分析(Multilocus sequence typing, MLST)分为18种序列类型(Sequence typing, ST)，其中ST857从空气、牛棚、卧床、粪便和生乳样品中均有检出[10]。此外，在挤奶过程中，致病菌可能通过挤奶工的手、毛巾和奶杯感染；不规则的真空波动会迫使细菌进入乳头管，从而可能导致新的感染[11]，从而引起奶牛乳房炎。

不同国家和地区引起临床乳房炎的环境性致病菌存在差异，美国威斯康星州50个大型牧场中，引起乳房炎的致病菌主要是E.coli、环境链球菌(Environmentalstreptococci)、Klebsiella和凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulasenegativestaphylococci)[12]，并且产色葡萄球菌(Sta.chromogenes)，表皮葡萄球菌(Sta.epidermidis)和模拟葡萄球菌(Sta.simulans)感染均可造成奶牛乳腺内持续性感染[13]。因此，准确鉴定出奶牛乳房炎感染的病原菌种类并解析其与环境病原微生物之间的相关性是防控治疗奶牛乳房炎的关键。

本研究以天津某牧场为例，通过美国加州乳房炎检测(California mastitis test, CMT)方法筛选乳房炎患病牛，采集乳房炎奶样及相关环境样品，使用选择培养基与血琼脂平板进行细菌的分离鉴定，分析乳房炎奶样与环境中分离菌株的多样性，判断牧场主要流行微生物种类与卫生管理防控薄弱环节，为牧场奶牛乳房炎防控与卫生管理提出建议与意见，为进一步研究乳房炎致病菌溯源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要试剂：10 mL无菌生理盐水管(带棉签)，购自华威锐科(HWRK)；麦康凯琼脂(Maconkey Agar)，购自索莱宝(Solarbio)；高盐甘露醇琼脂，购自OXOID；血琼脂平板与营养琼脂斜面均购自北京路桥技术股份有限公司；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR,TaqPCR Master Mix与超纯水(ddH2O)为品牌Takara；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

主要仪器：松下立体压力蒸汽灭菌器，日本；生化培养箱(HPS-250)与生物安全柜(HDL BSC-136011A2)均购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；移液器(Transferpettes S 50～1 000 μL)，德国Brand；恒温水浴锅(GFL-1083)，美国；分析天平(AL-204)，瑞士；均质机(Bag Mixer®400VW)，法国Interscience；PCR仪，美国Bio-rad。

1.2 试验方法

1.2.1样品采集

2019年9月在天津某牧场进行样品采集，该牧场泌乳牛存栏量约1 500头，采用大型转盘式挤奶操作，每天挤奶3次；卧床垫料使用经过干湿分离处理的粪便，并及时更换与补充垫料；牧场大罐奶体细胞数平均低于10万个/mL。通过CMT方法筛选出6头乳房炎患病奶牛，体细胞数(Somatic cell count, SCC)均≥1500 000 CFU/mL，奶牛胎次1～3胎。

1)乳房炎奶样采集：使用无菌采样瓶，对患病乳区的手工挤奶(200～250 mL)，弃前3把奶。

2)乳头皮肤及奶杯样品采集：奶牛患病乳区乳头皮肤以及相对应的奶杯内壁均使用生理盐水管(10 mL)中棉签拭子擦拭。

3)粪便样品采集：采用直肠掏粪方法收集粪便样品150 g。

4)环境样品采集：牧场将经过干湿分离晒干后的粪便作为卧床垫料，收集并处理未使用的新垫料(100 g)样品；在牛舍中采用3点取样法，随机选择3个卧床，采集3份卧床表面垫料(100 g)样品，混合；随机选择饮用水槽，收集患病牛饮用水(250 mL)；空气采用物理沉降法进行取样，使用无菌培养皿，静置于牛舍地面1.5 m高处1 h后进行下一步预处理[14]。新垫料、垫料、饮用水和空气样本每隔2 d采集1次，共采集3次。由于天气转凉，喷淋水(250 mL)只在采集第1次饮用水时收集，而患病牛饲料(500 g)在第1次与第3次采集。挤奶过程中使用的药浴液直接倾倒入50 mL离心管，得到前/后药浴液样品(50 mL)；并使用生理盐水管中棉签拭子擦拭前/后药浴杯杯口，得到前/后药浴杯样品(10 mL)，每隔1天采集1次，共采集9次。采样过程均使用无菌实验耗材，试验样品信息见表1。

5)收集空气样品的培养皿在牧场微生物检测实验室进行预处理，使用1 mL移液枪吸取85%生理盐水反复吹洗，得到15 mL菌液。其他所有样品在采集后1 h内放置于-20 ℃冰箱冷冻保存，之后使用恒温箱加冰袋3 h内运送至实验室进行-20 ℃冰箱冷冻保存，等待后续试验处理。

表1 采集样品信息

1.2.2不同样本中细菌的分离纯化

用移液枪分别取6头乳房炎患病牛奶200 μL，在麦康凯琼脂、高盐甘露醇琼脂和血琼脂平板涂布，37 ℃恒温培养18～36 h后，使用接种环在麦康凯琼脂、高盐甘露醇琼脂培养基上挑取菌落，血琼脂平板挑取不同形态、有溶血环的菌落，分别进行平板划线，分离乳房炎奶样中可培养的细菌，反复进行纯化，直到培养基上生长单一菌落，最后进行营养琼脂斜面划线，2～6 ℃保存。

乳头皮肤、奶杯、饮用水、喷淋水、前/后药浴液和前/后药浴杯样品采用与乳房炎奶样相同的步骤进行细菌分离纯化培养。

分装粪便、新垫料、垫料、饲料各25 g于225 mL 85%生理盐水中，均质1 min后，使用移液枪吸取100 μL，在培养基上涂布培养，操作同乳房炎奶样菌群分离纯化步骤。

分离纯化步骤均在超净工作台中进行。

1.2.316S rDNA PCR鉴定

1)水浴法提取DNA

接种环挑取营养琼脂斜面分离的菌株于50 μL Lysis Buffer中，80 ℃恒温水浴锅加热15 min，DNA提取完毕，-20 ℃保存。

2)PCR扩增

将水浴法提取的DNA进行PCR扩增，使用16S PCR通用引物[15]

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3

1 492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

反应体系为50 μL，分别加入TaqPCR Mastermix 25 μL，上游引物(27F)2 μL，下游引物(1492R)2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。

3)反应条件

预变性：94 ℃，4 min，循环数为1；PCR扩增：94 ℃变性，30 s，57 ℃退火，30 s，72 ℃延伸，90 s，重复循环30次；最后延伸：72 ℃，10 min，循环数为1；保温：10 ℃，∞。

4)测序结果比对

将测序序列在NCBI上Blast比对，获取与所测序列相似度高的序列，完成分离纯化菌株的鉴定。

1.2.4数据统计

使用Excel对样品中分离纯化细菌进行统计汇总。

2 结果与分析

2.1 乳房炎奶样品中细菌的分离与鉴定

6头乳房炎患病牛用药前牛奶通过选择培养基麦康凯、高盐甘露醇以及血琼脂平板进行涂布、分离、纯化培养，经16S rDNA扩增和测序，测序序列在NCBI数据库进行Blast比对，共鉴定出12株分离株。

鉴定出的分离株分别是1株E.coli，4株葡萄球菌(Staphylococcus)，3株芽孢杆菌(Bacillus)，包括2株坚强芽孢杆菌(B.firmus)和1株地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，其余为海洋放线菌(Kocuria)、罗思氏菌(Rothia)、产吲哚金黄杆菌 (Chryseobacteriumindologenes)、牛黄杆菌(Chryseobacteriumbovis)各1株。

2.2 畜舍样品中细菌的分离鉴定

畜舍样品包括7种，分别是乳房炎患病牛粪便(6份)、新垫料(3份)、垫料(3份)、饮用水(3份)、喷淋水(1份)、饲料(2份)和空气(3份)，共计21份样品。利用选择培养基和血琼脂平板培养，共分离纯化得到94株分离株，分类统计见表2和表3。

94株分离株中，主要是Bacillus，在粪便、新垫料、垫料、饮用水、喷淋水、饲料和空气中分别有22、2、1、8、1、3和8株，共计45株。Bacillus主要包括淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、B.licheniformis、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、B.firmus、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、圆形芽孢杆菌(B.circulans)、嗜热芽孢杆菌(B.aerophilus)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、安全芽孢杆菌(B.safensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、平流芽孢杆菌(B.stratosphericus)、B.cereus、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)、铜绿芽孢杆菌(B.aerius)共14种。肠杆菌属(Enterobacter)未在喷淋水与空气中分离出来，在粪便(2株)、新垫料(3株)、垫料(4株)、饮用水(2株)和饲料(1株)中分离得到。粪便、新垫料、垫料、饮用水、饲料和空气中分别分离鉴定出2、1、4、1、1和1株Staphylococcus分离株，共计10株。在新垫料与饲料中分别鉴定出1株Klebsiella，并且在新垫料中分离出一株假单胞菌属(Pseudomonas)分离株。在畜舍不同样品中分离出的其他细菌种类有：不动杆菌属(Acinetobacter)、大洋单孢菌属(Oceanimonas)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、泛菌属(Pantoea)、鸟氨酸芽孢杆菌属(Ornithinibacillus)和产蛋白酶中度嗜盐菌属(Thalassobacillus)。

2.3 奶厅样品中细菌的分离鉴定

奶厅样品包括6种样品，分别是前药浴液(9份)、前药浴杯拭子(9份)、乳房炎患病牛乳头皮肤拭子(6份)、奶杯拭子(6份)、后药浴液(9份)和后药浴杯拭子(9份)(按照挤奶操作流程排序)，共计48份，利用选择培养基和血琼脂平板培养，共分离纯化得到111株分离株，分类统计见表4。

表2 畜舍样品(粪便、新垫料、垫料)中细菌鉴定

表3 畜舍样品(饮用水、喷淋水、饲料、空气)中细菌鉴定

表4(续)

111株分离株中，主要是Bacillus，在前药浴液、前药浴杯拭子、乳房炎患病牛乳头皮肤拭子、奶杯拭子、后药浴液和后药浴杯拭子样品中，分别分离鉴定出22、24、14、12、14和12株Bacillus分离株，共计98株。包括B.licheniformis、B.firmus、B.subtilis、B.aerophilus、B.clausii、B.cereus、Lysinibacillus、海洋芽孢杆菌(B.oceanisediminis)、青贮窖芽孢杆菌(B.siralis)、海地芽孢杆菌(B.maritimus)、食苯芽孢杆菌(B.benzoevorans)、类地衣芽孢杆菌(B.paralicheniformis)和维尔兹芽孢杆菌(B.velezensis)共13种。在奶厅样品中分离出其他细菌包括类芽孢杆菌属(Paenibacillus)2株、Halobacillus1株、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)3株、少盐芽胞杆菌属(Paucisalibacillus)1株、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)1株、Ornithinibacillus2株和细菌BMV7 3株。

3 讨 论

3.1 分离鉴定细菌与奶牛乳房炎患病风险

研究表明，Staphylococcus(如Sta.aureus、Sta.chromogenes、Sta.epidermidis、Sta.simulans)、Coagulasenegativestaphylococci以及E.coli等是导致奶牛乳房炎疾病发生的主要致病菌，且与奶牛乳房炎的持续性感染有关[12-13]，Acinetobacter、Klebsiella、Shigella、Enterobacter均能够引起不同程度的乳房炎[12,16]，然而在本研究中，奶牛乳房炎奶样中分离出4株Staphylococcus和1株E.coli，因此，Staphylococcus和E.coli感染可能是引起奶牛乳房炎的致病菌。不同畜舍样品中也同样分离出不同种类的Staphylococcus，所以粪便、垫料、饮用水等环境样品可能是引起奶牛乳房炎致病菌的储存库。有研究从50个生乳样品和300个环境样品(包括土壤、水、饲料、空气、奶桶、挤奶机、牛舍、垫料、粪便、乳房、工作服、鞋底和员工手部样品)中共检测到B.cereus分离株56种[10]；并且空气的流动性似乎为致病菌的传播提供了动力[14]。可进一步通过细菌分型方法探究不同样品中分离菌株的相关性，为引起奶牛乳房炎致病菌的溯源工作奠定基础，Nieminen等[17]使用MLST方法在乳制品加工厂发现27株B.cereus分离株的17种ST。

研究表明，存在少数Bacillus如B.cereus、B.pumilus、B.licheniformis即可引起奶牛乳房炎[18-19]。本研究中，分别在奶牛乳房炎奶样、畜舍和奶厅样品分离鉴定出Bacillus3、45和98株，尤其在奶厅样品中分离株的比例较高(98/111株，88.29%)，因此，应当加强奶厅管理及卫生规范，减少细菌在挤奶过程中由乳头进入乳腺从而定植，或因挤奶真空压力过大造成乳头机械性损伤从而感染导致的奶牛乳房炎。大部分Bacillus可能不会引起奶牛乳房炎，但是大量存在的Bacillus对不同抗生素的敏感程度不同，甚至有的菌株携带耐药基因。Agersø等[20]研究不同来源的104株B.licheniformis和副地衣芽孢杆菌(B.paralicheniformis)，发现所有菌株都携带aph和aad链霉素耐药基因，cat氯霉素耐药基因和erm红霉素耐药基因，这些基因被认为是B.licheniformis和B.paralicheniformis的固有基因。在本研究中，奶厅样品中分离鉴定得到比例较高的Bacillus，可能对牧场中使用的抗生素产生了耐药性或携带了耐药基因，这对牧场奶牛乳房炎的治疗提出了巨大挑战。

3.2 分离鉴定细菌与乳及乳制品质量安全风险

环境样品中存在的大量细菌，例如Bacillus，不仅可能会引起奶牛乳房炎疾病或增加奶牛乳房炎治疗难度，还可能增加生鲜乳质量与安全隐患。本试验环境样品共鉴定出205株Bacillus，尤其是奶厅样品中分离出大量Bacillus(98/111株，88.29%)，主要有B.licheniformis、B.firmus、B.subtilis和B.cereus。Bacillus能形成芽孢，具有一定的耐受力(例如耐高温、耐低温、耐氧化，稳定性好等)，广泛分布在土壤、水、空气以及动物肠道等；另外，Bacillus具有产生生物膜的能力并且对酸和碱具有耐受性[17]。在多年养殖荷斯坦奶牛的牧场土壤中，分离鉴定出的优势Bacillus有B.cereus、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、B.lincheniformis[21]。某些Bacillus具有产生肠毒素、细胞毒素、溶血素的能力，越来越多的研究证明B.cereus能够产生多种毒素而导致食物变质和致病的能力。B.cereus在加纳(Ghana)的土壤、生乳和乳制品中普遍存在，并且对β-内酰胺类抗生素(例如氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林和头孢吡肟等)有耐药性[22]，并且在巴氏杀菌乳中分离得到的B.cereus，携带了多种产肠毒素基因(cytK、entFM、bceT和hlyII)，大多数分离株对β-内酰胺类抗生素和利福平有耐药性，对其他抗生素如环丙沙星、庆大霉素和氯霉素敏感[23]。在畜舍新垫料样品中分离得到Pseudomonas，研究表明，Pseudomonas在食品以及乳制品中普遍存在，是导致冷藏食品腐败的重要细菌。生牛乳及非生牛乳(如山羊奶和骆驼奶)中Pseudomonas菌群多样性高，在冷藏温度下具有高蛋白水解活性和产生肽酶的能力[24]，从而导致牛奶更容易变质。

3.3 分离鉴定细菌与不同地区细菌的流行性比较

导致奶牛乳房炎的病原微生物种类在不同地理区域内各不相同，天津某牧场流行的细菌与其他地区可能不同。在山东省不同地区的病原微生物检出率不同，青岛市Sta.aureus检出率最高(50.0%)，东营市E.coli检出率最高(40.0%)，日照市乳房链球菌(Str.ubers)检出率最高(31.25%)[25]。从辽宁西部5个城市的乳房炎奶样中分离鉴定得到的主要致病菌为Sta.aureus，E.coli和Str.agalactiae[26]。内蒙古巴彦淖尔地区4个不同的奶牛场共采集了80头乳房炎患病奶牛的牛奶样本，分离并鉴定了31种Staphylococcus，6种Streptococcus和14种Enterobacter[27]。总而言之，Sta.aureus、Str.agalactiae、E.coli、Str.dysgalactiae和Str.ubers分别是甘肃等9省市，广东等3省区，辽宁和上海，江苏和湖北，新疆和广西的优势种群[28]。本研究从天津某牧场乳房炎奶样中分离鉴定得到Staphylococcus，E.coli，未检测到S.aureus，未分离鉴定出其他乳房炎致病菌，但是在乳房炎奶样中分离出Bacillus。而且环境样品中分离鉴定得到大量Bacillus，尤其在奶厅的前药浴液、前药浴杯、乳头皮肤拭子和奶杯拭子样品中分离出B.licheniformis，B.firmus，B.subtilis和B.cereus，畜舍样品还分离出Enterobacter，因此，应该加强对该牧场奶厅的卫生管理与设备清洗工作，对该牧场或该地区乳房炎防治以及牧场消毒管理提供了依据。

本研究分离鉴定得到少数的Stenotrophomonas、Halobacillus、Pantoea、Oceanimonas和Ornithinibacillus等细菌，这些细菌大部分来自大自然水、土壤、植物等环境中，对人类和动物属于条件致病菌，能够引起人类疾病与动物伤口感染等。微病毒科细菌的7个原病毒区域称为BMV1-7，在前药浴液与后药浴杯中检测到了BMV7是其中之一。目前研究对微病毒科中噬菌体的遗传多样性和宿主范围认识较少，主要有衣原体(Chlamydia)、螺旋体(Spiroplasma)和蛭弧菌(Bdellovibrio)，有研究第一次鉴定和表征了拟杆菌属(Bacteroidetes)基因组中与微病毒科相关的前噬菌体，证明Bacteroidetes也是微病毒科细菌宿主[29]。

4 结 论

乳房炎奶样及环境样品中共分离鉴定出217株菌株，优势菌群为Bacillus(146/217株，67.28%)，畜舍样品中占比为47.87%(45/94)，奶厅样品中占比为88.29%(98/111)。乳房炎奶样中主要鉴定出4株Staphylococcus；畜舍样品中共鉴定出10株Staphylococcus和8株Enterobacter，新垫料与饲料中各鉴定出1株Klebsiella；在奶厅样品前药浴液与后药浴杯样品中分离鉴定出3株细菌BMV7。因此，牧场应该进一步加强奶厅挤奶操作过程中的卫生管理，加强对奶厅设备的清洗检查工作，减少和降低因奶牛乳头皮肤、奶杯、药浴液以及药浴杯中存在的细菌而引起的乳及乳制品质量安全问题以及奶牛乳房炎致病几率。本研究分离鉴定的单菌株，为进一步进行乳房炎致病菌的溯源工作奠定了基础。