红富士苹果树皮中的根皮苷的提取 及抗氧化活性研究

夏琳，赵媛，时志春，王丹，李军，王金兰，赵明，张树军

（齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

苹果（Malus pumila Mill.）为蔷薇科苹果属落叶乔木，是世界上种植量最大的果树之一，在我国辽宁、山西、山东、河北、陕西、甘肃、云南、四川、新疆等地广泛种植。研究表明，苹果枝叶及树皮富含根皮苷[1]。根皮苷是二氢查尔酮葡萄糖苷，具有降低血糖、改善记忆力、抗氧化、抗癌等多种重要的生物活性，在新型药物和天然保健食品开发中具有广泛的应用前景[2]。由于苹果树与其他果树一样，在其生长过程中，为了有效控制产量和质量，整形与修剪是必不可少的重要环节，但每年修剪下来的枝条一般会被丢弃或焚烧，得不到很好的利用，大量的苹果树枝资源被浪费。为开发苹果植物资源利用，本文以红富士苹果树皮为原料提取富集根皮苷的方法及所得提取物的抗氧化活性进行了初步研究。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

仪器：Aglient 1200 高效液相色谱仪（G1311A 四元泵，G1314B VWD 紫外检测器，Chemstation 色谱工作站，美国安捷伦公司）；BT 124S/BT 25S 分析天平，赛多利斯贸易有限公司。试剂：甲醇、乙腈均为色谱醇，购于山东禹王公司；水为娃哈哈纯净水；DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基＞97.0%），购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；VC（L-抗坏血酸＞99.0%），购于东京化成工业株式会社；磷酸，冰乙酸，正丁醇，无水乙醇均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司产品。

实验原料红富士苹果树皮于2016 年12 月20 日在甘肃省庆阳市庆城县采集，切碎后室内阴干晾干，经齐齐哈尔大学时志春博士鉴定为苹果树皮，标本（MP-20161220）收藏于齐齐哈尔大学天然产物研究室。

1.2 提取物的制备

1.2.1 水提法

取干燥的红富士苹果树皮250 g，加400 mL 水，80 ℃恒温浸泡提取1 h 后过滤，重复4 次，合并提取液得苹果树皮水提液。取苹果树皮水提液200 mL，每次用乙酸乙酯200 mL 萃取3 次，合并萃取液浓缩至恒重得乙酸乙酯萃取物（WE）。乙酸乙酯萃取后的水层每次用正丁醇200 mL 萃取3 次，合并萃取液浓缩至恒重得正丁醇萃取物（WE-D）；另取苹果树皮水提液4 份，每份200 mL，分别用正丁醇、乙酸乙酯-正丁醇 =4/1, 3/1, 2/1（V/V）的混合溶剂溶剂200 mL 萃取3 次，合并相同溶剂萃取液浓缩至恒重得正丁醇萃取物（WD）、乙酸乙酯-正丁醇4/1 萃取物（WE4/D1）、3/1 萃取物（WE3/D1）、2/1 萃取物（WE2/D1）；再取苹果树皮水提液200 mL，每次用正己烷-乙酸乙酯=2/1 的混合溶剂溶剂200 mL 萃取3 次，合并萃取液浓缩至恒重得正己烷-乙酸乙酯2/1 萃取物（WH2/E1），萃取后的水层每次用正丁醇200 mL 萃取3 次，合并萃取液浓缩至恒重得正丁醇萃取物（WH2/E1-D）；未萃取的水提液减压浓缩至恒重得苹果树皮水提物（W）。

1.2.2 甲醇提取法

取干燥的红富士苹果树皮200 g，每次用300 mL 甲醇室温浸泡提取3 d 后过滤，重复3 次，合并浸泡液混匀后分成2 份，1 份浓缩至恒重得到苹果树皮甲醇提取物（M）。另1 份浓缩至小体积加水混悬后，每次用300 mL 正己烷萃取3 次，合并萃取液浓缩至恒重得到正己烷萃取物（MH）；正己烷萃取后的水层每次用乙酸乙酯300 mL 萃取3 次，合并萃取液浓缩至恒重得乙酸乙酯萃取物（ME）；乙酸乙酯萃取后的水层每次用正丁醇300 mL 萃取3 次，合并萃取液浓缩至恒重得正丁醇萃取物（MD）。

将以上制得的各种提取物配置成质量浓度为0.50 mg/mL 的甲醇溶液，备用。

1.3 根皮苷的色谱分析

准确称量6.0 mg 根皮苷标准品，用甲醇溶解配制成浓度为1.00 mg/mL 的根皮苷标准溶液备用。在色谱仪上，选用Hypersil BDS-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）色谱柱，体积分数0.04%的磷酸水溶液和乙腈作为流动相，在检测波长为286 nm，柱温30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量5 μL 的色谱条件下梯度洗脱，梯度变化：5～15 min, 85/15→80/20; 15～25 min, 80/20→78/22; 25～30 min, 78/22→70/30; 30～40 min, 70/30→30/70。

取配制好的标准溶液，用甲醇分别配制浓度为0.02, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mg/mL 的溶液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下每次进样5 μL 进行色谱分析，每一质量浓度的标准溶液平行测量3 次，并记录峰面积，取得平均值。以峰面积（y）为纵坐标，以标准品质量（x）为横坐标，进行线性回归分析，制作标准曲线，得根皮苷标准品线性回归方程：y=1 899x-66.64，相关系数R2=0.999，表明在0.02～0.5 mg/mL的浓度范围内线性关系良好。在同样色谱条件下对“1.2”节中制得的苹果树皮各种提取物进行根皮苷的含量分析，每个样品平行测定3 次，峰面积取平均值，根据标准曲线计算根皮苷含量。

1.4 抗氧化活性测试

取7.5 mg DPPH 溶于20 mL 乙醇溶液中，配制成DPPH 乙醇溶液（测定时稀释10 倍）。将待测样品配置成浓度为200, 100, 20, 10, 2 μg/mL 的乙醇溶液；将VC 配置成浓度为100, 50, 10, 5, 1 μg/mL 的乙醇溶液，各取上述溶液20 μL 加入96 孔板中，再加入180 μL 稀释后的DPPH 溶液。在孔板中加入Blank（200 μL EtOH），Control（20 μL EtOH+180 μL DPPH），避光反应30 min，在517 nm 波长处测定吸光度，并按式(1)计算VC 和样品对DPPH 自由基的清除率（SR）。

式中，A照对为对照品吸光度；A样品为样品吸光度。

2 结果与讨论

2.1 根皮苷的含量分析

将红富士苹果树皮分别采用醇提和水提2 种方法进行提取，使用不同溶剂进行萃取制得13 种提取物，不同提取物中根皮苷相对含量测定结果如表1 所示。

依据表1 的结果，对比1 号和10 号根皮苷的含量可知，甲醇提取物中根皮苷含量明显优于水提物；对比2、3、4、12 和13 号根皮苷的含量可以看出，不管是甲醇提取液还是水提液，乙酸乙酯萃取物根皮苷的含量都较高，经乙酸乙酯萃取后再用正丁醇萃取，所得萃取物中根皮苷的含量大体相同，大约都在11%左右，说明乙酸乙酯萃取可以获得大部分的根皮苷，同时还说明对于乙酸乙酯-水体系和正丁醇-水体系，根皮苷在乙酸乙酯中的分配比高于正丁醇；但对比5、6 和7 号的结果可以看出，使用乙酸乙酯和正丁醇混合溶剂萃取并不是乙酸乙酯比例越大根皮苷含量越高，而是在乙酸乙酯-正丁醇体积比为2/1 时根皮苷的含量最高，达到59.7%。

表1 不同溶剂萃取物根皮苷的含量测定结果

2.2 不同提取物的抗氧化活性

以VC 作为对照，将红富士苹果树皮的水提物（W）、水提液乙酸乙酯萃取物（WE）、水提液乙酸乙酯萃取后丁醇萃取物（WE-D）、水提液丁醇萃取物（WD）、甲醇提取物（M）、甲醇提取液正己烷萃取物（MH）、正己烷萃取后乙酸乙酯萃取物（ME）、乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取物（MD）和根皮苷（P）共9 个样品进行DPPH 抗氧化活性测定，利用Excel 的FORECAST 命令，通过线性回归方程，计算IC50值，结果如表2 所示。

表2 不同溶剂萃取物以及对照品对DPPH 自由基的清除率

由表2 的结果可知，红富士苹果树皮的各种溶剂提取物均显示一定的抗氧化活性，相对而言，水提液乙酸乙酯萃取后丁醇萃取物（WE-D）、甲醇提取物（M）、甲醇提取物正己烷萃取后乙酸乙酯萃取物（ME）、甲醇提取物乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取物（MD）等几种提取物抗氧化活性稍强些，其中甲醇提取物乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取物（MD）最强，IC50值为160 μg/mL。此外，由于根皮苷的抗氧化活性不如多数提取物强，说明其中可能还含有抗氧化活性更强物质，其成分有待进一步研究。

3 结论

红富士苹果树皮中含有大量的根皮苷，从中提取富集根皮苷的较佳工艺条件为：80 ℃热水浸泡提取，提取液冷却至室温后用乙酸乙酯-正丁醇=2/1 的混合溶剂萃取，萃取液蒸出溶剂得提取物，其中根皮苷含量可达59.7%。红富士苹果树皮各种溶剂提取物显示一定的抗氧化活性，其中将干燥的红富士苹果树皮用甲醇室温浸泡提取，提取液浓缩至小体积加水分散后，用正丁醇萃取制得萃取物的抗氧化活性相对较好，IC50值为160 μg/mL。