黑豆中大豆异黄酮超声波法提取工艺优化

2021-03-19王双侠苏适柴宝丽

齐齐哈尔大学学报（自然科学版） 2021年2期

王双侠，苏适，柴宝丽

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061）

大豆异黄酮是具有雌激素样作用的天然活性物质，故又叫植物雌激素，因其多样而突出的生物学活性引起了国内外研究人员的广泛关注[1]。大豆异黄酮主要来源于大豆，近年来黑龙江省黑豆的种植量在逐步增大，因此针对黑豆的综合开发利用前景更为广阔。目前，大豆异黄酮的提取主要有溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法、连续逆流提取法等，其中超声波法与其它提取法相比，具有提取时间短、提取率高、成本低等优点[2]。为此本实验以黑豆为原料，采用超声波法提取，考察提取因素对大豆异黄酮提取率的影响，以确定其最佳提取工艺。

1 实验部分

1.1 实验材料及仪器

高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；超声波清洗器（上海皆准仪器设备有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（浙江恒威电子科技有限公司）；黑豆（产自黑龙江省绥化）；金雀异黄酮对照品（酷尔化学科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

黑豆中大豆异黄酮的提取工艺流程：将黑豆置于60 ℃烘箱中干燥后粉碎，采用正己烷脱脂处理后备用[3]。精密称取脱脂后黑豆粉10 g，加入250 mL 乙醇水溶液，超声提取，过滤，挥干溶剂，溶解残渣，测定大豆异黄酮含量并计算收率。

1.3 黑豆中大豆异黄酮含量的测定

1.3.1 绘制标准曲线

称取金雀异黄酮标准品10 mg 于50 mL 容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容。准确量取上述标准溶液0.00, 0.05, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50 mL 置于10 mL 容量瓶中，分别加入5.0 mL 95%乙醇，蒸馏水定容。在波长259 nm 下测定吸光度。以金雀异黄酮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线[4]，得出标准曲线回归方程：Y=1 560.328 7X-0.078（R2=0.999 0）。

1.3.2 黑豆中大豆异黄酮提取率的计算

大豆异黄酮提取物溶液在波长259 nm 下测定吸光度，根据标准曲线，得金雀异黄酮的浓度[5]。

异黄酮提取率＝ cVf / w ×10-6× 100%

式中，c 为所测定大豆异黄酮的浓度（μg/mL）；V 为供试品定容体积（mL）；f 为提取液稀释倍数；w 为原料重量（g）。

2 结果与讨论

2.1 正交实验设计

在单因素实验的基础上以乙醇浓度、物料粉碎度、超声时间、提取温度为考察对象，以大豆异黄酮提取率为指标，选取四因素三水平对提取工艺进行优化。采用L9(34)表，因素水平正交设计见表1。

表1 正交实验因素水平

采用正交实验对超声波法提取大豆异黄酮的工艺参数优化结果见表2。

对正交试验结果进行统计和方差分析，从表2 中极差可以看出，各因素对黑豆中大豆异黄酮提取率影响的大小顺序为乙醇浓度（A）＞超声时间（B）＞提取温度（C）＞物料粉碎度（D）；由表3 方差分析结果可知，乙醇浓度对黑豆异黄酮提取率有显著影响（P＜0.05），超声时间、提取温度及物料粉碎度无显著影响（P＞0.05）。从生产实际考虑，可以将提取工艺确定为A2B3C2D2，即物料粉碎后过20 目筛，以60%乙醇为溶剂，设定温度为50 ℃，超声提取50 min。

表2 正交实验设计与结果

表3 提取率方差分析

2.2 验证试验

称取黑豆粉末（20 目）3 份，每份10 g，按A2B3C2D2工艺，即采用60%乙醇，设定温度为50 ℃，超声提取50 min，测定大豆异黄酮并计算提取率，结果见表4。

由表4 可知，优选的工艺重复性良好，3 次实验大豆异黄酮提取率均在1.90%左右，表明该工艺稳定可行。

表4 验证实验结果

由于黑豆中含有较为丰富的脂类物质，为了更好地提取出目标成分，在提取之前采用正已烷为溶剂对提取原料进行了脱脂处理，然后再经过浓缩回收正已烷，正已烷为极低毒的重要化工溶剂，广泛应用于医药及食品行业，常用于脱脂处理和植物油的萃取。

一般情况下，提取温度越高，大豆异黄酮在提取溶剂中的溶解度越高，因此，在一定范围内提高提取温度有利于提取率的提升。而实验中发现，在提取温度升为50℃以上后，大豆异黄酮的提取率提升变得并不明显，随着温度的进一步提高，提取率反而有下降的趋势，这可能是因为过高的温度会破坏大豆异黄酮的活性，而使其提取量下降[6-7]。从正交实验的结果来看，较高浓度乙醇可使异黄酮类物质增加渗透溶解，因而大豆异黄酮的平均提取率会随着乙醇浓度的增加而提高，但乙醇浓度达到70%时，其提取率反而有小幅度的下降，这是因为当乙醇体积分数过高时，同时也增加了糖类物质及蛋白质等大分质物质的聚集，从而影响了异黄酮类物质的析出[8]。另外，实验发现粉碎度适当提高，有利于提高大豆异黄酮的提取率，但粉末细度达到40 目以上后，提取率反而下降，考虑可能是因为粉末过细增加了后续过滤操作的难度，从而造成了一定的损失。在提取温度及粉碎度两个因素中，实验从大豆异黄酮的提取率、操作难度及节能等综合因素来考虑提取工艺的优选。