不同培养基成分对蝴蝶兰组织培养褐化的影响

●冯 宁（青州市花卉高科技博览园管理委员会 山东 青州 262500）

蝴蝶兰花色相对艳丽，有 “兰中皇后”的美誉，不但拥有较强的观赏价值，经济价值也愈发突出，因此，不管是在国外花卉市场还是国内市场都十分受欢迎。

受其自身特性影响，蝴蝶兰几乎在自然条件下无法分株繁殖，并且如果种子发育不完全，萌发将很难进行，因此组织培养开始成为其最主要的繁殖方式。在对蝴蝶兰进行组织培养时，因组培材料被切断，体内的酚类物质会与氧结合形成褐色的醌类物质，即组培届所说的“褐化”。“褐化”物质——醌类与蝴蝶兰组织中蛋白质发生化学反应，不仅影响蝴蝶兰花梗的萌芽率，还严重影响组培苗后期生长及成品苗的开花质量和性状稳定。因此，本文对培养基影响因素进行分析，以期抑制褐化产生，提升培养质量。

1 实验材料与方法

本实验选取蝴蝶兰花梗作为实验材料。

1.1 取材

选择芽体饱满、无病虫害的花梗，将其剪下，去除花蕾和开放的花朵。将花梗用洗洁精清洗干净后，用流水冲洗2h 以上。

1.2 外植体消毒与接种

在超净工作台中将花梗切成3～4cm 的小段，每段要带有1 个芽。然后用75%的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗2～3 次后，再用0.1%的升汞溶液浸泡15min 左右，随后用无菌水冲洗5～6 次。将消毒后的花梗放在灭菌后的滤纸上，吸干水分，将两端被药蚀的伤口部位切掉，然后按照腋芽在花梗上的着生位置将花梗段进行分类，接种到培养基中。

1.3 试验设计

据前期研究积累本研究设计了以基本培养基、蔗糖浓度、活性炭含量3 个水平的实验方案（表1），每个处理接种30 个外植体，重复3 次，30d 后统计结果。

表1 不同培养基处理的成分及浓度试验方案

2 结果与分析

通过对试验数据进行统计、分析发现，基本培养基、蔗糖浓度和活性炭含量都对蝴蝶兰组培褐化率和萌芽率有影响（表2）。腋芽位置对萌发率的影响较明显，对褐化率影响不大。

表2 不同培养基对蝴蝶兰组培苗褐化率和萌芽率的影响

2.1 基本培养基对蝴蝶兰组培褐化的影响

相关研究表明，培养基中大量元素的含量与兰科植物杜鹃兰的组织培养褐化率存在相关性[1]。为了探究大量元素含量对蝴蝶兰组培褐化是否也有影响，本试验共设置了三种基本培养基，分别为MS、1/2MS 和1/3MS。

试验结果表明，随着培养基中大量元素含量的减少，蝴蝶兰组培的褐化率也随之降低。同时发现，适当降低大量元素含量，还可以提高蝴蝶兰腋芽的萌发率。其中，接种在1/2MS 培养基上的花梗，其腋芽萌发率超过90%，并且长势更好。但是，腋芽萌发率并不会随着大量元素含量的降低而持续上升，接种在1/3MS 上的腋芽萌发率发生了下降。由此可知，大量元素含量过少，也会影响萌发率。

2.2 蔗糖浓度对蝴蝶兰组培褐化的影响

分析试验数据可以发现，随着蔗糖浓度的升高，外植体褐化率呈现上升的趋势，由此可见，低浓度的蔗糖含量有利于抑制蝴蝶兰组培褐化现象的产生。而在对萌芽率的影响方面，发现在30g/L 蔗糖浓度条件下，腋芽的萌发率较高，但差异并不是很明显。综合褐化率、萌芽率和经济性原则，可知较为适宜的蔗糖浓度为20g/L。

2.3 活性炭含量对蝴蝶兰组培褐化的影响

试验中发现，在培养基中添加活性炭可以有效抑制褐化现象的产生。各组处理中添加了活性炭的，其外植体褐化率远低于未添加活性炭的。然而活性炭含量的提高对褐化现象抑制作用的提升并不是很明显。考虑到经济性原则，选择在培养基中添加1g/L 活性炭较为合适。

2.4 腋芽位置对蝴蝶兰组培褐化的影响

本试验对蝴蝶兰花梗上不同位置的腋芽分别进行了接种、培养、观察发现，花梗基部第一个腋芽培养效果相对较差，萌发率大约为30%。而其余几个腋芽，其萌发率都要远高于第一个腋芽。尤其是位于花梗中间部位的2～3 个腋芽培养效果最好。分析原因，可能是因为中间部位的腋芽发育更为充实。由此可见，不同的取材部位也会对蝴蝶兰组培效果产生一定的影响。

3 讨论与总结

在基本培养基对组培褐化影响研究方面，王立娅[2]认为，改良KC 培养基是最适合蝴蝶兰增殖生长的培养基，其次为1/2 MS 培养基，与本试验的结果1/2 MS 培养基最佳不完全一致，下一步试验将增加基础培养基种类，针对组培褐化影响深入研究。有研究者在蔗糖浓度对组培褐化影响中发现，同一质量浓度下添加不同糖源的培养基对牡丹花珊瑚台愈伤组织的继代培养效果以蔗糖、麦芽糖较好。在苏丹草培养基中低浓度的蔗糖(10～20g/L)能降低褐化率，但同时也降低了愈伤诱导率，而高浓度的蔗糖（40～50g/L）能提高愈伤诱导率，但同时也增加了褐化率。试验结果表明，蝴蝶兰添加活性炭能够抑制蝴蝶兰褐化现象，与王立娅等[3]以蝴蝶兰继代培养获得的丛生芽为外植体，活性炭能有效防止褐化和促进生长的结论基本一致，与刘真华等[4]得出活性炭能有效控制蝴蝶兰褐化和促进生长的结果部分一致。

廖焕琴等[5]对朱顶红组培苗褐化进行研究，认为朱顶红在MS 基本培养基中生长状况较好,褐化程度最低，朱顶红继代培养基中添加1.0 g/L活性炭可有效抗褐化，与本实验结果类似，印证了本实验结果的可靠性。

在抑制褐化方面，本试验发现较低的大量元素和蔗糖含量，以及在培养基中添加活性炭可以起到明显的降低褐化率的作用。在以1/2MS 为基本培养基、蔗糖浓度为20g/L、活性炭含量为1g/L 条件下，可以取得较低的褐化率和较高的萌芽率。在激素选择方面，由于已经有大量的研究报道，故本试验未做重点研究。有学者对蝴蝶兰组织培养予以研究后，发现生长素6-BA 与某种细胞分裂素进行搭配使用，最终效果会明显高于单独使用。

综上所述，结合褐化率、萌芽率和生产经济性原则，较为理想的蝴蝶兰组培培养基为1/2MS+20g/L 蔗 糖+1g/L 活 性 炭+5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+6.0g/L 琼脂。