5-磷酸二酯酶抑制剂对庆大霉素所致豚鼠耳毒性影响的研究*

梁媛 张淑君 李庆红 黄跃雁 马桂琴 曹静 张洁 刘春丽 袁玉洁 李俊鹏

药物性聋是感音神经性聋的常见病因之一，其中以氨基糖苷类抗生素所致的感音性聋较为多见，庆大霉素是氨基糖苷类抗生素中较重要的一员，过去近半个世纪里，国内外学者对庆大霉素耳毒性机制及其防治进行了大量的研究工作，尽管找寻对抗庆大霉素耳毒性药物已取得一定成绩，但并不尽人意。5-磷酸二酯酶(PDE5)是具有调节细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平的一种蛋白质，其参与了哺乳动物许多正常生理过程，如：通过下调平滑肌细胞中的环磷酸鸟苷表达水平来维持血管、肠管以及阴茎等器官的功能，同时还可调节哺乳动物神经细胞的生成与凋亡[1]。目前，PDE5抑制剂通过改变NO/cGMP代谢途径已经在性功能障碍、心血管系统、肺动脉等方面取得了公认肯定的疗效。Jaumann等[2]通过实验发现，在耳蜗中内、外毛细胞和螺旋神经节神经元里均有PDE5蛋白的表达，并与部分环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶-1(Prkg1)共定位，提出在这些细胞中存在PDE5-cGMP-Prkg1信号传导，且这种信号传导可能参与了耳蜗内毛细胞功能的损伤过程。前期实验结果[2]也显示，PDE5抑制剂可以在一定程度上减轻豚鼠噪声性听损伤[3]。为此，本研究拟通过制造庆大霉素耳毒性豚鼠模型，并给予选择性PDE5抑制剂他达那非作为拮抗药物，探讨PDE5抑制剂是否能够减轻庆大霉素对豚鼠耳蜗功能的损伤，为氨基糖苷类抗生素所致感音性聋的临床防治提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选择耳廓反射灵敏的2月龄健康杂色雄性豚鼠36只(河北医科大学实验动物中心提供),体重240～305 g，随机数字表法分为正常对照组、庆大霉素组和PDE5抑制剂组，每组12只。各组豚鼠在经戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉及无菌条件下于颅顶部双侧皮层听区硬膜外手术埋植不锈钢丝慢性电极(记录电极)，牙科水泥固定，稳定1周后进行实验。

1.2实验方法

1.2.1各组动物给药方法 正常对照组未给予特殊处理，庆大霉素组和PDE5抑制剂组豚鼠均给予腹腔注射硫酸庆大霉素(80 毫克/支，华北制药集团制剂有限公司，国药准字H13020452)120 mg·kg-1·d-1，连续3周；建立庆大霉素耳毒性动物模型。然后，庆大霉素组豚鼠给予腹腔注射生理盐水(4 ml·kg-1·d-1)，PDE5抑制剂组豚鼠腹腔注射他达那非(美国礼来制药厂，批号:C090487)2 mg·kg-1·d-1(将他达那非用生理盐水稀释，4 ml/kg，每日1次)，均连续给药4周。

1.2.2听性脑干反应(ABR)测试 建模前1天、庆大霉素给药3周后及PDE与抑制剂组他达那非给药1、2、4周时分别对庆大霉素组和PDE5抑制剂组进行ABR测试；对照组在相同时间点测试。测试方法：测试仪器为Keyponit型4通道听觉脑干诱发电位仪(Dantec，丹麦)，先给予豚鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉使其进入睡眠状态，将其固定在测试笼中，置于隔声电屏蔽室内。将针形记录电极置于颅顶正中皮下, 参考电极和接地电极分别置于同侧和对侧乳突, 极间电阻小于或等于 5 kΩ。 双耳交替给声, 扬声器放在豚鼠头前45°方向，同时距离测量耳道大约2厘米处，采用短声刺激, 刺激速率为20次/秒，带通滤波30～3 000 Hz，叠加1 024次，扫描时间15 ms，刺激声极性为交替波。刺激声强度从80 dB SPL 开始, 以5 dB为步距将刺激声逐渐下降到10 dB SPL，以引出波Ⅲ的最小刺激强度为ABR阈值。同时记录刺激声强为80 dB SPL时波Ⅰ潜伏期。

1.2.3耳蜗电镜标本制作 从三组中各任意选取6只豚鼠,取其右耳耳蜗作为扫描电镜观察对象。豚鼠完成最后给药(分别应用他达那非、生理盐水4周)及ABR测试后断头处死,取出颞骨，在解剖显微镜下打开听泡，蜗尖钻孔及镫骨脱位，2.5%戊二醛前固定，在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中漂洗3次，每次10 min，1%锇酸固定1 h,再经磷酸盐缓冲液漂洗、乙醇梯度脱水和干燥，金属镀膜，在扫描电镜下观察耳蜗毛细胞形态变化。

2 结果

实验过程中豚鼠无死亡，未发现中耳感染、行走不稳等迹象，给药后均未出现明显的药物不良反应。

2.1实验前后三组豚鼠ABR反应阈比较 组内比较：实验前后空白对照组豚鼠ABR反应阈差异无统计学意义(P>0.05)；庆大霉素组和PDE5抑制剂组豚鼠在庆大霉素注射后均表现为ABR反应阈升高，且均明显高于同组建模前，差异均具有统计学意义(P<0.05)。给予他达那非后，PDE5抑制剂组ABR反应阈呈下降趋势，用药4周后ABR阈值明显低于用药前水平，但仍明显高于建模前水平，差异均有统计学意义(P<0.05)；庆大霉素组用生理盐水后ABR反应阈仍呈上升趋势，用药4周后与用药第1周相比，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

组间比较：三组豚鼠在建模前ABR阈值差异无统计学意义(P>0.05)，在庆大毒素注射三周后及继续用药1周、2周及4周后，庆大霉素组与PDE5抑制剂组ABR阈值均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。PDE5抑制剂组与庆大霉素组相比，除建模前和庆大霉素注射后这两个时间点以外，用他达那非后各时间点ABR阈值均较庆大霉素组低(均为P<0.05)。经重复测量方差分析，三组在组间、不同时点间、组间与不同时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 三组豚鼠建模前、庆大霉素注射3周后及继续用药1、2、4周的ABR反应阈比较

2.2三组豚鼠波ABR波Ⅰ潜伏期比较 组内比较：实验前后空白对照组豚鼠ABR波Ⅰ潜伏期无明显变化(P>0.05)。庆大霉素组建模后波Ⅰ潜伏期持续性延长，建模后各个时间点波Ⅰ潜伏期相较建模前延长(P<0.05)。PDE5抑制剂组豚鼠在用他达那非药后1、2、4周波Ⅰ潜伏期持续下降，均低于庆大霉素组，且与建模前和庆大霉素注射后相比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。

组间比较：在庆大霉素注射后，庆大霉素组和PDE5抑制剂组与对照组相比较，其潜伏期均有所延长，差异有统计学意义(P<0.05)；PDE抑制剂组与庆大霉素组相比较，除庆大霉素注射3周这一时间点以外，继续用药1、2、4周后波Ⅰ潜伏期均有显著性差异(P<0.05)。三组在组间、不同时点间、组间与不同时点间交互作用差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 三组豚鼠建模前、庆大霉素注射3周后及继续用药1、2、4周时ABR波Ⅰ潜伏期比较

2.3三组豚鼠耳蜗扫描电镜观察 空白对照组豚鼠耳蜗外毛细胞形态正常，排列整齐，界限清楚(图1a)。庆大霉素组外毛细胞损伤明显，主要表现为听毛紊乱、融合及缺失(图1b)。PDE5抑制剂组豚鼠耳蜗损伤相对较轻，外毛细胞形态结构基本正常，与空白对照动物相比差异不大，外毛细胞听毛仅有轻微倾倒融合现象(图1c)。

3 讨论

目前研究[4～6]认为，氨基糖苷类抗生素所导致的耳毒性与毛细胞内Ca2+超载有着密切的关系。氨基糖苷类抗生素进入内耳后，可被内耳中毛细胞吸收，使细胞内Ca2+表达水平异常增加，影响腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的合成，从而引起毛细胞凋亡，造成不可逆性的听损伤。一方面，内耳中存在着NO/cGMP路径，其通过调节细胞内Ca2+浓度来维持正常生理功能，尤其是在听觉传导、稳定内环境以及改善内耳循环等方面发挥着关键作用，其中，耳蜗中的Hensen细胞在整个听觉传导中有着重要地位，其细胞间存在丰富的缝隙连接，氨基糖苷类抗生素进入内耳之后，Hensen细胞中ATP异常升高，可阻断细胞间缝隙连接，从而改变正常的耳蜗功能[7]。与此同时，外毛细胞的低渗应激也能够增加细胞内Ca2+浓度，同时促进NO产生。研究发现，在外毛细胞的相同亚细胞区域中，可以检测到PDE5和Prkg1非常接近，说明外毛细胞中可能存在cGMP信号传导复合物[8]。国外学者研究发现，NO/cGMP途径可以减少在离体状态下细胞内的Ca2+升高幅度[9]，从而改善由ATP引起Hensen细胞之间缝隙连接通讯的抑制，有利于维持耳蜗正常的功能。另一方面，ATP通过P2γ受体引起血管内皮细胞释放内皮舒张因子，从而引起血管扩张，而后者证明就是NO。已证实NO是听觉系统的一种重要生物活性物质，参与耳蜗的生理及病理变化过程，它具有双重作用：体外研究表明[10]，生理剂量的NO对耳蜗有保护作用，可通过抑制毛细胞内过量的钙负荷，即抑制细胞内钙超载来发挥作用；而过量的NO可导致毛细胞的缺失，甚至还可以作为凋亡的启动子诱导毛细胞和神经细胞等发生凋亡。说明ATP与Ca2+互相作用且可能通过NO/cGMP途径影响耳蜗的生理功能[11]。

他达那非作为一种选择性PDE5抑制剂，能够通过抑制海绵体内分解cGMP 的PDE5来增强NO并调节Ca2+浓度来发挥作用。cGMP作用于包括cGMP依赖性蛋白激酶(Prkg)在内的特异性受体蛋白，表达Prkg神经元和非神经元细胞，如：豚鼠耳蜗支持细胞和螺旋神经节神经元(SGNs)[12]，通过PDE水解第二信使分子cGMP终止信号。研究表明，PDE5-Prkg1-cGMP-PARP信号肽存在于耳蜗毛细胞内，PARP1是一种表达广泛的DNA缺口末端传感器，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为底物催化PAR加入受体蛋白，特别是组蛋白、转录因子和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)本身[13]，后者因DNA断裂被激活，促进转录、复制和DNA碱基切除修复[14]。矛盾的是，NO的毒性作用，又与DNA损伤、PARP1的过度激活有关，并且伴随NAD+耗尽或ATP耗尽导致细胞死亡；在这种情况下，PDE5抑制剂既可以增强cGMP信号传导的保护作用又不会因NO过多而增加破坏作用，特别是因为PARP活化也可能由cGMP直接引起[15，16]。本研究结果显示，在庆大霉素致豚鼠耳毒性造模成功后，PDE5抑制剂组应用他达那非4周，庆大霉素组应用生理盐水4周，庆大霉素组ABR平均阈值仍然高达49 dB SPL以上，波Ⅰ平均潜伏期达1.98 ms，可以认为该组动物已有永久性阈移；而PDE5抑制剂组豚鼠在应用他达那非1、2周， ABR阈移及波Ⅰ潜伏期延长的幅度均明显低于同期庆大霉素组,在用药4周后,ABR阈值明显低于同期庆大霉素组及应用他达那非前水平；提示他达那非对庆大霉素所致豚鼠耳蜗毛细胞的损伤具有一定的减轻作用。本研究通过电镜观察还发现，庆大霉素组耳蜗外毛细胞损伤严重，PDE5抑制剂组外毛细胞损伤明显轻于前者。由此推论腹腔内注射一定剂量的他达那非，可以减轻庆大霉素对豚鼠听功能的损害，对耳蜗毛细胞具有一定的保护作用。

综上所述，PDE5抑制剂他达那非对庆大霉素所致豚鼠听功能及毛细胞损伤有一定的拮抗作用，但其作用机制及是否是通过迷路屏障到达内耳微环境起作用尚需进一步研究，能否使用PDE5抑制剂作为感音神经性聋的治疗方法有待深入研究及论证。