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噪声损伤和苯扎贝特干预对豚鼠耳蜗脂肪酸转运蛋白1和4表达的影响△

2021-03-19胡一勇石敏杨风波吕萍蒋晴晴袁硕龙张悦杨仕明于宁

听力学及言语疾病杂志 2021年2期
关键词:毛细胞豚鼠耳蜗

胡一勇 石敏 杨风波 吕萍 蒋晴晴 袁硕龙 张悦 杨仕明 于宁

脂肪酸转运蛋白1和4(fatty acid transport protein,FATP1,FATP 4)对长链脂肪酸具有高度亲和力而参与各类组织和器官的脂肪酸摄取、转运[1, 2]。既往研究发现豚鼠耳蜗Hensen细胞含有大量脂滴——中性脂肪酸[3],但是其转运体FATP1和/或FATP4是否在耳蜗内表达并参与耳蜗脂肪酸代谢从而调节耳蜗功能目前少有研究。少量研究[4,5]发现噪声暴露会导致豚鼠耳蜗Hensen细胞分泌脂滴以及小鼠耳蜗Hensen细胞高度降低,提示脂肪酸因噪声等因素在耳蜗内被转运。据此本研究采用中高强度白噪声长时间刺激耳蜗建立噪声性耳聋动物模型,并使用提高FATP表达、促脂肪酸β-氧化的药物苯扎贝特干预[6],试图提高耳蜗内FATP表达,以促进Hensen细胞分泌脂滴,然后观察噪声及药物干预前后脂肪酸转运体1和4在耳蜗的变化,从而探索耳蜗内脂肪酸以及FATP1、FATP4与噪声性听力损失的关系,为进一步探讨脂肪酸代谢调节耳蜗功能的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康成年雄性Dunkin Hartley豚鼠21只,体重250~300 g,耳廓反射灵敏,购自北京市科宇动物养殖中心,动物实验许可证号SYXK(川)2018-18。将21只听力正常豚鼠随机分为对照组15只(30耳)、干预组6只(12耳)。

1.2主要试剂和设备 主要试剂:苯扎贝特(sigma,B7273)、Mouse Anti-FATP1 primary antibody(Abcam,ab69458)、Rabbit Anti-FATP4 primary antibody(Invitrogen,PA5-42446)、Rabbit Anti-Myosin 7a primary antibody(Abcam,ab3481)、Goat Anti-mouse Alexa Fluor 555(Abcam, ab150114)、 Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 647(Abcam,ab150083)、特异性脂肪酸探针Nonpolar BODIPY Probes 493/503(Invitrogen,D-3922),封闭用山羊血清(absin,abs933a)、0.01M PBS、4%组织细胞固定液(CoolabeR SL1830)、Triton X-100(sigma,9002-93-1)、10% EDTA(Coolaber SL-3070),二甲基亚砜(Coolaber,CD4731);Mouse Anti-Beta-actin primary antibody(Affinity,T0022),山羊抗兔IgG(H + L) HRP(ZSGB-BIO,ZB-2301)、山羊抗鼠IgG(H + L) HRP(ZSGB-BIO,ZB-2305)、RIPA Lysis Buffer(康为世纪,CW2334)、BCA法蛋白质定量试剂盒(普利莱,P1511)、Super ECL Plus 超敏发光液(普利莱,P1010)。

主要设备及耗材:解剖显微镜(Olympus,日本)、共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)、TDT测听仪器(TDT III设备,美国)、电泳仪(Tanon VE-180)、转膜仪(Tanon VE-186)、凝胶成像仪(赛智 610C)、显微镊、组织剪、3 ml塑料滴管等。

1.3听性脑干反应(ABR)检测 对照组及干预组分别在开始噪声暴露前及暴露后的第6天、第12天、第24天进行ABR检测。用1%戊巴比妥钠麻醉豚鼠,连接TDT电极:记录电极从耳廓前缘连线中点进针植入颅顶皮下,参考电极植入测试耳乳突部皮下,接地电极植入对侧耳乳突部皮下。耳机置于测试耳外耳道口0.2 cm处。采用Biosig32 软件系统检测豚鼠短声(click)、短纯音(tone burst)(4、8、16 kHz)ABR反应阈。刺激声强度设定为90 dB SPL,按10 dB递减,在接近反应阈时刺激声强度递减间隔为5 dB,以能分辨出可重复的ABR波Ⅲ的最低刺激强度为阈值。

1.4噪声性聋动物造模 噪声暴露前随机选取对照组3只(6耳)豚鼠进行耳蜗取材作为正常对照。然后将对照组其余12只(24耳)和干预组6只(12耳)豚鼠置于50 cm×30 cm×25 cm的笼内,每只豚鼠之间用隔板隔开,扬声器置于笼的上方,控制豚鼠活动范围内的声强相差不大于2 dB,使用110 dB白噪声连续暴露12天、每天4小时;干预组在开始噪声暴露同时予以苯扎贝特(5 mg·kg-1·d-1)灌胃干预。

1.5耳蜗冰冻切片制作 对照组在噪声暴露后第12、24天进行耳蜗取材,干预组在第24天取材。用1%戊巴比妥钠麻醉豚鼠,待其进入深度麻醉状态后,立即断颈处死;快速取出耳蜗,置于4%多聚甲醛溶液中。在体视显微镜下用显微镊挑开窝尖,撕破圆窗膜,再轻轻将镫骨推入卵圆窗;用3 ml移液管从蜗尖挑开处缓慢灌入4%多聚甲醛,可见淡黄色淋巴液自卵圆窗及圆窗流出,重复灌流2~3次;再将灌流后耳蜗浸泡于4%多聚甲醛(4 ℃)过夜。随后将耳蜗放入10% EDTA脱钙液中脱钙5~7天;脱钙的耳蜗用15%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液梯度脱水各2 h后,置于OTC胶中浸胶2 h,最后换用新鲜OTC胶冷冻(-20 ℃,2 h)包埋。使用冰冻切片机切片,厚度选择12 μm,组织芯片直接贴于带正电荷的载玻片上,最后将切片置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.6荧光染色 将耳蜗冰冻切片用PBS快速漂洗三次后,用0.25% Triton X-100处理30 min,滴加10%羊血清封闭非特异性抗原(37 ℃,2 h),吸去血清,滴加一抗稀释液(FATP1,1∶100;FATP4,1∶100;Anti-Myosin 7a,1∶400),4 ℃孵育过夜,阴性对照用PBS代替一抗。吸去一抗,PBS溶液洗三次,每次5 min,滴加二抗稀释液(Goat Anti-mouse Alexa Fluor 555,1∶400;Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 647,1∶400)及脂肪酸特异性探针(Nonpolar BODIPY Probes,0.01 mg/ml),37 ℃避光孵育1 h,吸去二抗,PBS溶液洗三次,每次15 min,用DAPI复染细胞核10 min,PBS溶液洗去DAPI,甘油封片。每张荧光染色标本均在Leica SP8激光共聚焦荧光显微镜下观察FATP1、FATP4在耳蜗基底膜的表达情况以及脂肪酸的分布情况,并采集图像。

1.7Western blot检测 按分组与时间点随机选取豚鼠,豚鼠麻醉后断头,迅速取下听泡,用止血钳夹掉前庭并尽量去除耳蜗周边骨质,以一个耳蜗作为一个样本,碾磨耳蜗,加入裂解液提取蛋白,按BCA法检测蛋白浓度,配制分离胶为12%、浓缩胶浓度为5%。每个样本蛋白上样总量约30 μg,先恒压80 V,待蛋白样本进入到分离胶后,改为恒压120 V,直到目的蛋白跑到合适位置(通过观察预染蛋白Marker)。转膜条件:全湿转,恒压为100 V,60~120 min。将PVDF膜取出浸泡于甲醇中15 s,加入5%牛奶(in 1X TBST)封闭液,室温封闭2 h。将PVDF膜转入用5%牛奶(in 1X TBST)溶液稀释的一抗溶液中,4 ℃过夜孵育(FATP1,1∶500;FATP4,1∶1 000;Anti-Beta-actin,1∶3 000)。1X TBST洗三次,每次8 min。将洗好的膜放入5%牛奶(in 1X TBST)溶液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液中(山羊抗兔,1∶4 000;山羊抗鼠,1∶4 000),室温孵育1 h。用TBST洗三次,每次7 min。取ECL超敏发光液A、B,将A、B取相同体积混匀,孵于膜上,避光反应1 min。将膜置于凝胶成像仪中进行检测。凝胶图像分析:将所得图片用Image J软件分析目的条带灰度值。最后以FATP1(FATP4)/actin表示FATP1(FATP4)的相对表达量。

1.8统计学方法 采用Image J测量耳蜗切片荧光强度及Western blot条带灰度值。各组计量资料以均数±标准差表示,并采用SPSS 20.0统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本t检验统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1噪声暴露前后各组ABR反应阈比较 对照组、干预组豚鼠噪声暴露前后ABR反应阈见表1、2。噪声暴露后6、12~24天,对照组短声ABR反应阈无明显差异(F=3.04,P>0.05),但均高于噪声暴露前(P<0.01),表明噪声性聋动物模型成功建立。噪声暴露后第6、12天,干预组短声ABR反应阈与对照组无明显差异(t=-0.14,P>0.05)(t=1.00,P>0.05),但第12天干预组4、8 kHzABR反应阈较对照组明显下降(t=6.46,P<0.05)(t=3.53,P<0.05)。在噪声暴露后24天,干预组4 kHz反应阈基本恢复到噪声暴露前水平(t=-0.71,P>0.05)。

表1 噪声暴露前及暴露后6、12、24天对照组豚鼠click-ABR和tb-ABR反应阈

2.2荧光染色观察结果

2.2.1脂滴在豚鼠耳蜗的分布 正常豚鼠耳蜗内脂类物质主要分布于Corit器外侧的Hensen细胞、螺旋神经节、血管纹(图1)。

表2 噪声暴露前及暴露后6、12、24天干预组豚鼠click-ABR和tb-ABR反应阈

2.2.2噪声暴露前、后豚鼠耳蜗内FATP1、FATP4表达变化 噪声暴露前FATP 1主要表达于Corti器(图2a、c)、螺旋唇(图2a、d),螺旋神经节细胞、螺旋韧带、血管纹等少量表达;噪声暴露后第12天FATP 1主要表达于Corti器、齿间细胞,略齿细胞、螺旋突、螺旋韧带、螺旋神经节细胞(图2b)。荧光定量分析结果提示,FATP 1在全耳蜗表达较噪声暴露前增加,其中在Corti器、Hensen细胞、螺旋突、螺旋韧带表达明显增加(P<0.01),在螺旋神经节、血管纹表达有所增加(P<0.05),但是在螺旋唇表达降低(P<0.05)(图3)。

噪声暴露前FATP 4主要表达于耳蜗Corti器及螺旋韧带(图4a),但Corti外侧的Hensen细胞(图4b)、螺旋神经节、血管纹极少表达或不表达;噪声暴露后,干预组和对照组FATP4在耳蜗的表达分布一致,主要表达于耳蜗Corti器及其外侧的Hensen细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、螺旋唇(图4c、d、e、f)。荧光定量分析显示,各组FATP 4在全耳蜗(F=8.32,P<0.05)、Corti器(F=393.88,P<0.05)的表达均存在差异,其中对照组(第12天)和干预组(第24天)FATP4在Hensen细胞、螺旋唇、螺旋神经节的表达均较噪声暴露前明显增加(P<0.01);FATP4在耳蜗侧壁组织表达变化存在差异,干预组(第24天)FATP4在螺旋突、螺旋韧带的表达均较噪声暴露前及对照组(第12天)降低(P<0.05),在血管纹的表达增加(P<0.05),对照组(第12天)FATP4在血管纹的表达较噪声暴露前及干预组(第24天)明显降低(P<0.01)(图5)。

2.3Western blot检测结果 各组豚鼠耳蜗内均有FATP1、FATP4表达(图6a),噪声暴露前后FATP1和FATP4在耳蜗内的表达均有一定差异(FATP1:F=8.54,P<0.01;FATP4:F=10.79,P<0.01)。在噪声暴露后第12天FATP1(0.53±0.01,较噪声暴露前(0.15±0.10)明显上调(t=-5.36,P<0.01),干预组噪声暴露后第24天FATP1(0.69±0.10)较噪声暴露前(0.15±0.10)明显上调(t=-7.60,P<0.01),但较对照组噪声暴露后第24天(0.49±0.26)无明显差异(t=-1.50,P>0.05)。对照组噪声暴露后第12天FATP4(0.67±0.09)较噪声暴露前(0.14±0.07)明显上调(t=-9.49,P<0.01),噪声暴露后干预组第24天FATP4(0.73±0.15)较噪声暴露前(0.14±0.07)明显上调(t=-7.20,P<0.01),但较对照组第24天(0.601±0.27)差异无统计学意义(t=-0.85,P>0.05)(图6b)。

3 讨论

听觉感受器细胞(外毛细胞和内毛细胞)由内柱、外柱、Deiter、Hensen和Claudius等支持细胞支撑坐落在耳蜗内基底膜上,其中有“耳蜗放大器”[9]之称的外毛细胞主要感受声音(85%的微音电位来自外毛细胞),一方面将机械的声波转换为膜电位,另一方面在膜电位形成的同时使外毛细胞收缩伸展,产生主动放大作用,使声音放大,具有双向放大作用,这是大量耗能的过程[3]。同样具有舒缩功能的心肌细胞所需的大量能量主要由脂肪酸β-氧化提供[8],所以,外毛细胞极有可能存在与心肌细胞相同的能量代谢方式。而耳蜗内淋巴中葡萄糖浓度仅为0.6 mmol/L,鼓阶外淋巴葡萄糖浓度为3.6 mmol/L,前庭阶外淋巴葡萄糖浓度为3.8 mmol/L[9,10],提示淋巴液中的糖可能不足以给耳蜗外毛细胞舒缩及时提供足够的能量支持。因此,早在二十世纪五十年代就有学者提出在听觉器官受刺激的过程中,为了获得营养和氧气,毛细胞必须有一个高度发达的营养辅助系统,其中含有大量脂滴并且能提供大量脂肪酸[3]的Hensen细胞可能是主要营养细胞之一[11]。

既往研究[12]发现小鼠耳蜗有脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding prote,FABP)表达,其中心脏型脂肪酸结合蛋白[H(heart-type)-FABP]主要表达于耳蜗的外柱细胞、内柱细胞、外指细胞,脑型脂肪酸结合蛋白[B(Brain-type)-FABP]主要表达于耳蜗的Hensen细胞、内指细胞、内柱细胞。虽然尚不清楚FABP在不同耳蜗支持细胞群中的功能,但极可能是FABP通过影响支持细胞的脂肪酸环境来调控毛细胞的功能。Suzuki等[13]通过观察FABP3(H-FABP)基因敲除小鼠的听力变化特点,没有证明FABP 3在耳蜗的功能,仅发现耳蜗功能还受其他FABP的代偿作用影响,而没有表现出听力损失;表明FABP可能是调节耳蜗功能的重要蛋白因子。而FATP是促进长链和极长链脂肪酸进入细胞的完整跨膜蛋白[14],同样是决定脂肪酸能否进出细胞参与一系列生物学反应的关键蛋白家族之一[15]。细胞及组织的脂肪酸代谢水平则受FATP、FABP等蛋白因子的共同影响。

本研究初步验证了豚鼠耳蜗脂类物质主要分布于基底膜外侧的Hensen细胞、螺旋神经节、血管纹。噪声暴露前,FATP 1主要表达于Corti器、齿间细胞、略齿细胞;FATP 4主要表达于耳蜗Corti器及螺旋韧带,但Corti器外侧的Hensen细胞极少表达或不表达;提示FATP1、FATP4在正常豚鼠耳蜗内的分布存在组织特异性。文中结果显示噪声暴露前后FATP 1和FATP 4在豚鼠耳蜗的表达均存在明显差异,在噪声暴露后第12天时,对照组FATP1、FATP4表达较正常对照的豚鼠显著增加(P<0.05),而之后FATP1、4均维持在一定的高水平,提示噪声损伤可提高耳蜗内FATP1和FATP4的表达。

从文中结果看,噪声及苯扎贝特干预可使FATP 1和FATP 4在耳蜗内的表达变化存在部位差异,对照组FATP1在Corti器、Hensen细胞、螺旋突、螺旋韧带表达较噪声暴露前明显增加;而对照组(第12天)和干预组(第24天)FATP4在Hensen细胞、螺旋唇、螺旋神经节的表达均较噪声暴露前明显增加,并且FATP4在耳蜗侧壁组织表达变化存在差异,即干预组(第24天)FATP4在螺旋突、螺旋韧带的表达均较噪声暴露前及对照组(第12天)降低,在血管纹的表达增加,而对照组(第12天)FATP4在血管纹的表达较噪声暴露前及干预组(第24天)明显降低。血管纹含有丰富的血管组织,有旺盛的物质转运、能量转换等功能[16],苯扎贝特是提高脂肪酸转运蛋白表达、促脂肪酸β-氧化的药物[6],在给予噪声暴露的同时给予苯扎贝特干预,很可能通过分别提高FATP1以及FATP4在上述耳蜗局部组织的表达,并且通过FATP 1和FATP 4的相互代偿、补足,共同促进血管纹和/或Hensen细胞向毛细胞转运脂肪酸,为毛细胞的主动运动提供能量物质,从而防止噪声性听力损失。但是对照组(第12天)FATP4在血管纹的表达较噪声暴露前明显降低,很可能造成耳蜗内脂肪酸转运失代偿而不能维持耳蜗毛细胞在噪声暴露下的正常功能,从而造成听力损失。豚鼠耳蜗内Hensen细胞脂滴主要分布于耳蜗第三、四回基底膜(低中频听力),可以提供丰富的脂肪酸,但是Hensen细胞脂滴在第一、二回基底膜(高频听力)分布较少[3],这可能也是本研究中干预组在噪声暴露后第12天听力开始恢复并且4、8 kHz听力损失恢复较对照组快、而对照组及干预组16 kHz听力难以恢复的重要原因。

文中结果表明噪声暴露可提高FATP1和FATP4在豚鼠耳蜗局部组织的表达水平,从而促进耳蜗内脂肪酸转运;促脂肪酸代谢药物(苯扎贝特)干预可进一步改变FATP4在耳蜗的表达分布,从而在一定程度上防止噪声性听力损失或促进噪声性听力损失恢复。本研究为进一步探索耳蜗脂肪酸代谢调节耳蜗功能的机制提供了实验依据,被转运的脂肪酸具体通过何种机制改善噪声性听力损失还需进一步研究。

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