水杨酸钠诱导大鼠螺旋神经节细胞发生程序性坏死的研究*

黄巧 尹时华 侯涛 任毅 廖行伟 翟思佳 王晓荣

程序性坏死是由受体相互作用蛋白激酶介导的非依赖半胱天冬酶(caspase)的一种新型细胞死亡方式，在形态上与坏死非常相似，与传统的细胞坏死不同，其可以受调控，且在凋亡介导的胱天蛋白酶被抑制情况下被激活。当被病毒感染或caspase-8激活受抑制时，死亡配体[包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Fas配体和TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)]依次进行磷酸化和激活受体相互作用蛋白激酶-1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)和受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)，活化的RIPK3使混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)磷酸化，导致MLKL的构象变化，磷酸化的MLKL形成寡聚体，并易位至生物膜上，从而通过形成孔道和破坏膜完整性而导致坏死[1～3]。因此，由RIPK1、RIPK3和MLKL组成的蛋白复合物称为坏死体，是程序性坏死的关键调控分子[4]。一些研究表明RIPK3可能参与螺旋神经节(SGN)的损伤，Wang等[5]利用哇巴因建立SGN损伤模型研究发现，RIPK3介导的程序性坏死参与SGN损伤。Choi等[6]在体外和体内研究发现，RIPK3介导的程序性坏死是顺铂诱导耳毒性的主要细胞死亡途径。但水杨酸钠耳毒性是否存在RIPK1/RIPK3/MLKL途径参与的程序性坏死尚无研究报道。本课题组先前研究发现，水杨酸钠通过激活caspase-3诱导豚鼠耳蜗SGN发生细胞凋亡，但经特异性caspase-3抑制剂处理后凋亡细胞减少不明显，其可能有不依赖caspase-3的凋亡途径存在[7]，由此提出，水杨酸钠可能损伤SGN,可能存在RIPK1/RIPK3/MLKL途径参与的程序性坏死。程序性坏死特异性抑制剂necrostatin-1(Nec-1)，对RIPK1作用具有高度特异性，在超过400种人类激酶的筛选中，Nec-1对RIPK1的选择性较其他激酶高出1 000倍以上，其能够抑制RIPK1活性，阻断程序性坏死的进行，在损伤模型中起保护作用[8, 9]。因此，本研究采用Nec-1干预程序性坏死途径，探讨RIPK1/RIPK3/MLKL介导的程序性坏死在水杨酸钠诱导大鼠SGN损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选择耳廓反应灵敏、鼓膜完整且未暴露于噪声环境及无耳毒性药物使用史的健康雄性成年SD大鼠，体重280～330 g，实验前进行ABR检测，筛选ABR反应阈小于40 dB SPL的48只合格大鼠，随机分为空白对照组、人工外淋巴液(artificial perilymph,APL)组、水杨酸钠(sodium salicylate,SS)组和Nec-1组,每组12只。

1.2主要试剂 人工外淋巴液(APL配制：NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl22 mM, NaH2PO41 mM, Glucose 10 mM, NaHCO312 mM, MgCl21 mM的溶液，pH 7.4±0.2)，水杨酸钠购于sigma公司，Nec-1(11658，Cayman Chemical，USA)，逆转录盒与荧光定量PCR试剂盒购于GeneCopoeia，RIPK1抗体(bs-5805R，bioss)，RIPK3抗体(BS7363，bioworld)，MLKL抗体(K004074P，solarbio)。引物利用Primer Premier设计，通过BLAST分析，挑选最佳序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，RIPK1引物序列为F:5′CCAGCCAGCCAAATCAAAGT3′；R: 5′TGGCTTACACTTGGCCCATA3′，产物长度198 bp。RIPK3引物序列为F:5′TAGTTTATGAAATGCTGGACCGC3′；R: 5′GCCAAGGTGTCAGATGATGTCC3′，产物长度145 bp。MLKL引物序列为F:5′TCTCCCAACATCCTGCGTAT3′；R: 5′TCCCGAGTGGTGTAACCTGTA3′，产物长度104 bp。选取GPHAD作为内参对照，序列为F: 5′AGTGCCAGCCTCGTCTCATA3′；R:5′TGAACT TGCCGTGGGTAGAG3′，产物长度189 bp。

1.3听性脑干反应(ABR)检测 所有动物实验前与动物处死前(最后一次给药12小时后)均进行ABR检测。采用Neuro-Audio.听觉诱发电位仪，操作软件为Neuro-Audio.v2010，麻醉满意后将大鼠置于隔声室，记录电极置于额顶正中，参考电极置于同侧耳廓，接地电极置于鼻尖。click短声刺激，刺激率21次/秒，带通滤波300～3 000 Hz，叠加次数1 024次，强度从90 dB SPL开始并以10 dB或者5 dB递减，以能引出明确重复的、可检测到的波II的最小刺激强度为ABR反应阈，并重复检测2次。

1.4各组用药及给药方法 空白对照组：左耳经圆窗注入人工外淋巴液，腹腔注射生理盐水；APL组：左耳经圆窗注入含Nec-1人工外淋巴液；SS组：左耳经圆窗注入人工外淋巴液后腹腔注射水杨酸钠350 mg·kg-1·d-1；Nec-1组：左耳经圆窗注入Nec-1后经腹腔注射水杨酸钠350 mg·kg-1·d-1；圆窗给药24小时后给予腹腔注射，各组连续给药7天。圆窗给药方法：10%水合氯醛全身麻醉满意后将大鼠置于固定板上，左耳后常规备皮、消毒、铺巾，利多卡因局部浸润麻醉，于耳后沟后2 mm做弧形切口约1 cm长，钝性分离软组织，暴露听泡，在解剖显微镜下于听泡后上方用钻孔并暴露圆窗龛，以分别浸泡有人工外淋巴液、Nec-1的明胶海绵置于圆窗膜表面，Nec-1浓度(300 μM)和剂量(100 μL)根据以前的报道选择[10]。关闭术腔，逐层缝合软组织及皮肤，切口涂红霉素软膏，取左耳朝上侧卧位，待自然清醒。

1.5耳蜗取材及切片制备 待各组动物最后一次检测ABR后，打开胸腔，剪开右心耳，以生理盐水及4%多聚甲醛灌注心脏，待头颈四肢僵硬快速断头，打开听泡取出耳蜗，在解剖显微镜下打开圆窗及前庭窗，于蜗尖处挑开小孔，用1 ml注射器由蜗顶灌注4%多聚甲醛，再将标本置于4%多聚甲醛4 ℃固定48 h。取出耳蜗置于10%EDTA溶液室温脱钙1个月，隔天更换一次脱钙液。随后经脱水、透明、石蜡包埋后切片，片厚4 μm。

1.6HE染色 石蜡切片置于60 ℃烤箱3 h，将切片取出进行二甲苯脱蜡和梯度酒精水化；蒸馏水冲洗，苏木素染色5 min，水洗；蒸馏水浸泡1 min；1%盐酸酒精分化数秒，自来水返蓝30 min，伊红染色2 min；梯度酒精脱水，二甲苯透明，晾干封片，镜检。为了进行定量分析，在10×40视野下总共对SGN区的坏死细胞数进行五次计数，计算出100个SGN细胞中已经坏死的细胞数量。

1.7RNA提取和实时荧光适量PCR(qRT-PCR)法 待大鼠麻醉充分快速断头，迅速取出耳蜗置入无酶水配制的PBS溶液中，在解剖显微镜下剥离蜗壳，取出膜迷路组织并迅速放入含有TRIZOL的1.5 ml EP管中，用玻璃研磨棒将组织完全研磨碎，冰上放置10 min。12 000 g 4 ℃离心5 min，吸取上清液加入200 μl氯仿震荡15 s，冰上静置5 min。12 000 g 4 ℃离心15 min，吸取上层水相层，加入200 μl异丙醇与200 μl高盐溶液(0.8 mol/L柠檬酸钠与1.2 mol/L NaCl的混合液)，颠倒混匀后冰上静置10 min。12 000 g 4 ℃离心10 min，弃上清保留沉淀并加入75%乙醇1 ml洗涤沉淀。12 000 g 4 ℃离心5 min，倒去乙醇，晾干沉淀，无酶水溶解RNA。测RNA浓度，并分装保存于-80 ℃。取总RNA 1 μg，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，然后通过美国ABI公司的Stepone进行qRT-PCR。以1 μl cDNA为反应模板，按照荧光定量PCR试剂盒说明书配置反应20 μl体系进行qRT-PCR。反应条件：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃32 s，循环40次。选取GPHAD作为内参对照，采用2-△△Ct法进行数据分析，检测各组大鼠SGN RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表达水平。

1.8免疫组织化学染色 石蜡切片置于60 ℃烤箱3 h，将切片取出进行二甲苯脱蜡和梯度酒精水化，蒸馏水冲洗；切片置于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH=6.0)放入高压锅高压修复5 min，室温冷却后PBS浸洗；阻断内源性过氧化物酶10 min，PBS冲洗；滴加一抗(RIPK1∶PBS=1∶400,RIPK3∶PBS=1∶100,MLKL∶PBS=1∶200，阴性对照用0.01 MPBS代替一抗)，4 ℃湿敷过夜；室温复温1 h，PBS冲洗；滴加反应增强液10 min，PBS冲洗；滴加增强酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物10 min，PBS冲洗；DAB溶液显微镜下显色；苏木素复染，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，自来水返蓝30 min；脱水，透明，晾干，封片、镜检。细胞膜和/或细胞质棕黄色颗粒者为阳性表达，无棕黄色颗粒者为阴性表达。在10×40视野下选取螺旋神经节区域，采用Image-pro plus6.0图像分析软件测定单位面积阳性细胞表达的平均光密度值(Average optical densities，AOD)，检测各组大鼠SGN RIPK1、RIPK3、MLKI蛋白表达。

2 结果

2.1各组用药前后ABR反应阈比较 给药前各组大鼠双耳ABR阈值均低于40 dB SPL。给药后各组间ABR反应阈差异有统计学意义(F=101.962，P<0.000 1)，经两两比较，给药后对照组和APL组ABR阈值差异无统计学意义(P=0.149)。给药后水杨酸钠组ABR阈值较对照组和APL组升高(分别为P<0.000 1，P<0.000 1)。Nec-1组ABR阈值较水杨酸钠组降低(P<0.000 1)，但较对照组和APL组仍有升高(P<0.000 1，P<0.000 1)，差异有统计学意义。Nec-1组经抑制剂处理后ABR反应阈较水杨酸钠组降低(P<0.000 1)，但较对照组及APL组仍有升高(分别为P<0.000 1，P<0.000 1)(表1)。

表1 各组大鼠左耳给药前后ABR阈值比较

2.2各组HE染色SGN细胞形态及坏死细胞计数比较 对照组及APL组SGN细胞清晰(图1a、b)，但仍存在少许坏死细胞。与对照组相比，水杨酸钠组SGN的形态学变化明显，具有细胞死亡特征，表现为细胞变圆，细胞质肿胀，细胞界限不清(图1c)；Nec-1组坏死细胞数量较水杨酸钠组减少(图1d)。对照组、APL组、水杨酸钠组及Nec-1组SGN中坏死细胞计数分别为11.6%±1.517%、12.8%±1.483%、47.8%±2.387%及30.6%±1.140%，各组间坏死细胞计数比较差异有统计学意义(F=361.228，P<0.000 1)；与对照组相比，水杨酸钠组SGN坏死细胞计数最高，差异有统计学意义(P<0.000 1)；Nec-1组SGN坏死细胞计数较水杨酸钠组少(P<0.000 1)，但较对照组仍有升高(P<0.000 1)；而对照组与APL组坏死细胞计数差异无统计学意义(P=0.28)。

2.3qRT-PCR显示各组大鼠SGN中RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表达量 qRT-PCR结果显示GPHAD、RIPK1、RIPK3和MLKL的扩增曲线整齐均匀(图2)，溶解曲线均呈特异性单峰(图3)，表明扩增产物特异性良好、无二聚体及非特异性扩增。各组间RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA的表达量有明显差异(P<0.000 1，P<0.000 1，P<0.000 1)，其中，对照组中表达水平表达均最低，水杨酸钠组表达强烈增加，Nec-1组表达量均明显低于水杨酸钠组(表2)。

表2 各组大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表达量

2.4免疫组化结果 免疫组化结果显示RIPK1、RIPK3和MLKL主要表达在SGN的细胞质、细胞膜及部分细胞核处；对照组和APL组SGN区域几乎无表达，水杨酸钠组SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL的表达明显增加，Nec-1组RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的表达量较低，但Nec-1组仍较对照组表达升高，该蛋白质表达模式与mRNA表达模式一致，各组间RIPK1在SGN的表达量有明显差异(F=274.607，P<0.001)。经两两比较发现，与对照组和APL组相比，水杨酸钠组的SGN中RIPK1表达强烈增加(分别为P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1组SGN中RIPK1表达量较水杨酸钠组明显降低(P=0.001)，但Nec-1组与对照组、APL组比较，RIPK1表达水平仍有升高(分别为P<0.000 1，P<0.000 1)(图4)。各组间RIPK3在SGN的表达量有明显差异(F=292.711，P<0.000 1)，与RIPK1表达结果一致，与对照组和APL组相比，水杨酸钠组的SGN中RIPK3表达强烈增加(分别为P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1组SGN中RIPK3表达量显著低于水杨酸钠组(P<0.000 1)，但仍高于对照组和APL组(分别为P=0.002，P=0.004)(图5)。各组间MLKL在SGN的表达量有明显差异(F=89.591，P<0.000 1)，与RIPK3表达结果一致，与对照组和APL组相比，水杨酸钠组的SGN中MLKL表达强烈增加(P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1组SGN中MLKL表达量较水杨酸钠组降低(P<0.000 1)，但仍高于对照组、APL组(分别为P=0.006，P=0.008)(图6)。

3 讨论

程序性坏死可能是SGN细胞死亡的基本和替代/补充机制，在阻断细胞凋亡途径后进一步揭示，当凋亡介导的胱天蛋白酶被抑制时，由RIPK1和RIPK3执行程序性坏死。RIPK1和RIPK3参与炎症和细胞死亡，MLKL被RIPK3磷酸化激活，形成坏死体而导致细胞程序性坏死[11, 12]。先前的研究不断探索水杨酸钠诱导耳鸣的分子机制，caspase3介导的凋亡通路已被证明是水杨酸钠诱导SGN损伤中主要的死亡通路[13]。在体内水杨酸钠通过影响环氧合酶活性，阻断花生四烯酸向前列腺素H2转化，花生四烯酸浓度的增加会影响N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，同时引起外周和中枢效应，NMDA受体在内部毛细胞和耳蜗螺旋神经节神经元的突触上表达[14]。在体外，水杨酸钠增强了NMDA类在耳蜗螺旋神经节神经元上的谷氨酸能电流[15]，将NMDA拮抗剂直接应用到耳蜗液中，可阻止水杨酸钠诱导的耳鸣[16]，这些研究表明水杨酸钠耳毒性机制非常复杂，涉及多条通路，然而程序性坏死是否也参与水杨酸钠诱导的耳毒性尚无报道。

程序性坏死可被死亡配体[包括肿瘤坏死因子(TNF)，Fas配体和TRAIL]诱导，Hwang等[17]观察到在小鼠耳蜗中注射300 mg/kg水杨酸钠可使肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor type 1,TNFR1)mRNA表达水平高于肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosis factor receptor type 2,TNFR2)的mRNA表达水平。长期施用水杨酸钠后，TNFα基因的表达增加，然而在停止水杨酸钠给药后14天，TNFα mRNA的表达水平又回到了正常基线[18]。此外，Wei等[19]研究发现水杨酸钠处理3小时后，Tnfsf10(TRAIL)、Lta(TNFSSF1)、Fas和Tnfrsf5 4个TNF家族的成员显示上调，这些研究表明水杨酸钠诱导的耳鸣可能与TNFα基因的过表达有关。本研究结果显示，水杨酸钠诱导的耳毒性与SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL，即坏死体的高表达水平显著相关，反映了坏死性细胞死亡途径，使用Nec-1处理时，RIPK1、RIPK3和MLKL表达降低，这表明在水杨酸钠致SGN损伤中存在RIPK1/RIPK3/MLKL介导的程序性坏死，阻滞该途径对于有效的神经保护可能是必需的。但是，需要进一步研究分别敲除小鼠RIPK1、RIPK3和MLKL基因在水杨酸钠诱导的耳毒性中的作用。

Nec-1是程序性坏死特异性抑制剂，能够抑制RIPK1活性，阻断程序性坏死的进行。Nec-1已广泛用于实验模型研究受体相互作用蛋白激酶在程序性坏死中的作用。Zheng等[10]在噪声性听力损失模型中研究发现，噪声暴露一小时后，耳蜗基底部区域中的外毛细胞RIPK1和RIPK3蛋白水平增加，呈现凋亡和坏死特征，用Nec-1进行治疗可减少噪声引起的RIPK1和RIPK3增加，并减少外毛细胞坏死。Wang等[5]也报道哇巴因引起的SGN损伤促进RIPK3表达增加，但可通过应用Nec-1来抑制。本研究Nec-1组SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL表达降低，且SGN中细胞的坏死率减少，与上述研究结果一致；然而，Ruhl等[20]报道Nec-1的保护作用在顺铂诱导耳毒性的离体外毛细胞实验中未得到反映。表明药物诱导的耳毒性非常复杂，存在由胱天蛋白酶和RIP激酶相互调节，任一途径的抑制可能导致死亡向另一途径转移，因此，Nec-1抑制程序性坏死可保护SGN细胞免受损伤。

SGN的损伤不仅可导致感音神经性听力损失，也可能是水杨酸钠引起耳鸣的机制之一，本研究提示程序性坏死是一种SGN损伤的重要途径，其重要性与细胞凋亡相似；抑制程序性坏死以保护SGN免受损伤，可能是治疗耳鸣和SGN损伤相关性听力损失的一种方法。