基于蓝光光盘 /光驱技术的生物分子嵌入式检测系统与仪器的研发

徐晓宇，张校亮，谭 慷，李晓春

(太原理工大学 a.物理与光电工程学院，新型传感器与智能控制教育部与山西省重点实验室，b.生物医学工程学院，太原 030024)

消费类电子产品如数码相机、智能手机、扫描仪、光盘光驱等，满足了人们日常生活的多方面需求。从科研人员的角度看，这些消费类电子产品具有强大的光电传感、图像采集、数据处理等能力，可以应用到医疗诊断领域，从而弥补传统检测仪器和检测方法的时间长、成本高、操作复杂等缺点[1]。其中，光盘具有良好的光学特性和纳米级的表面粗糙度，是进行生化反应的良好基底材料；光驱具有精密的光学读取机制和伺服控制系统，能够作为生物信号读取装置，国内外许多研究人员相继开展基于光盘/光驱的生化分析研究[2]。2000年美国KIDO et al[3]首次提出标准光驱读取生物光盘实现检测的概念。西班牙MORAIS et al[4]通过将标准CD光盘改造为半透射半反射特殊光盘，并在光驱内安装提取透射光强信号的光电二极管接收器和光敏触发器，经软件数据处理后实现定量检测。区别于硬件改造的方式，本课题组深入研究光盘数据编码、保护与纠错机制，提出了一种软件解决的数字化生物分子检测方法[5]。基本原理是光盘表面的生物阵列会干扰光驱激光读取刻录数据，反映到光盘质量诊断软件上就是产生数据校验错误，且产生错误的情况与分析物浓度相关。利用该原理，在CD、DVD上实现了孕酮HCG、重金属离子等物质的定量检测[6-7]。相比于CD、DVD，蓝光光驱采用更短波长的405 nm激光，使得激光聚焦光斑更小[8]。同时蓝光光盘采用了更加高效的纠错编码格式，因而具有高效的突发错误纠正能力，在进行生物分子检测时表现出更高的检测灵敏度和分辨率[9]。利用该技术，成功建立了基于蓝光技术的数字化分子检测平台[10]，实现了黄曲霉毒素B1的定量检测和多种心肌梗死标志物的联合诊断[11-12]。

利用数据纠错原理的标准光驱检测方法无需对硬件改造，可作为现场快速检测的低成本、高灵敏度检测工具。然而目前该方法依赖Windows平台的非开源商业光盘质量诊断软件，导致无法脱离电脑，无法实现系统集成；数据分析需借助多个数据处理软件手动完成，过程较为繁琐，依赖电脑且无法实现自动化分析。因而该方法用于现场快速检测时存在一定的局限性。而嵌入式系统对用户来说，是以应用为中心，软硬件可裁剪，对硬件的体积、成本、功耗等有严格要求的专用计算机系统[13]。因此可利用嵌入式技术开发专用性的检测仪器，通过软硬件裁剪，实现更加便携的应用。

基于此，本文提出了基于蓝光光盘/光驱技术的生物分子嵌入式检测系统与仪器的研发。通过构建以ARM开发板和蓝光光驱为核心的硬件平台，缩小了装置的体积；将开源光盘质量诊断软件和开发的数据处理程序整合为完整的检测系统应用程序，实现了光盘上生物样本的自动化分析；通过墨点阵列和链霉亲和素实验验证了本系统的可行性和准确性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

磷酸氢二钠(质量分数≥99.5%)、磷酸二氢钠(质量分数≥99.0%)、氯化钠(质量分数≥99.5%)、氢氧化钠(NaOH，质量分数97.0%)、明胶(Gelatin，微生物学级)、无水柠檬酸(质量分数≥99.5%)、牛血清白蛋白(BSA)购买于美国Aladdin公司；2-吗啉乙磺酸(MES，质量分数≥99.0%)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，质量分数≥97.0%)、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，质量分数≥98.0%)、Tween-20购买于美国 Sigma-Aldrich公司；对苯二酚(质量分数≥99.0%)、硝酸银(质量分数≥99.8%)购买于天津科密欧化学试剂有限公司；氨基修饰的生物素(Amine-PEG2-biotin)购买于美国Thermo Scientific公司；纳米金-链霉亲和素结合物(Nanogold-streptavidin conjugate)购买于美国Nanoprobes公司。

紫外臭氧清洗机(PSD-UV，美国 Novascan公司)，喷墨打印机(Epson L810，日本Epson公司)，ARM开发板(JZ2440，深圳百问网科技有限公司)，标准蓝光光盘(25GB BD-R，日本Verbatim公司)，蓝光光驱(PX-B950SA，日本Plextor公司)。

1.2 实验方法

1.2.1嵌入式生物分子检测系统设计

嵌入式生物分子检测系统包含硬件系统和软件系统，如图1(a)所示。硬件部分包括ARM开发板(集成显示屏、触摸屏等常用外设)、外置光驱转接板、蓝光光驱，蓝光光驱通过USB接口与ARM开发板通信。软件部分包括嵌入式底层软件和图形化应用程序，开发平台为PC Linux，经交叉编译后运行于ARM开发板硬件。通过开发和移植U-Boot引导加载程序、Linux内核、根文件系统以及蓝光光驱等硬件驱动程序，完成嵌入式系统底层软件开发，为应用程序提供运行环境。图形化应用程序实现用户功能，即控制蓝光光驱进行生物分子浓度定量检测。图形化应用程序包括蓝光光盘质量诊断模块、数据处理模块、曲线拟合模块以及应用程序GUI(图形用户界面)。蓝光光盘质量诊断模块实现光驱控制、纠错扫描并输出纠错数据；数据处理模块实现对纠错数据的处理，对特征信号定位并进行积分运算；曲线拟合模块输出定量检测结果并显示拟合曲线；应用程序GUI是上述三个功能模块的可视化操作界面。使用C语言开发命令行程序，使用QT开发应用程序GUI，最终将各个模块整合为完整的嵌入式平台应用软件。开发的嵌入式分子检测系统装置实物图如图1(b)所示(光驱尺寸170 mm×146 mm×42 mm，开发板尺寸105 mm×88 mm×40 mm).

图1 嵌入式分子检测系统设计与实现

基于蓝光技术的生物分子检测方法采用光盘质量诊断软件PlexUtilities进行纠错扫描，该软件为Windows平台非开源商业软件，无法移植运行于嵌入式Linux平台，因此本系统的蓝光光盘数据纠错模块首先借助开源光盘质量诊断软件QPxTool-0.7.2的代码来实现。移植并修改QPxTool开源代码，使之运行于嵌入式系统中，并输出光盘纠错数据结果。

蓝光光盘数据纠错是以纠错块为单位进行的，一个纠错块大小为64 kB，光盘质量诊断软件输出长距码(LDC)和突发指示子码(BIS)两种规范的测试参数[14]。25 GB BD-R的用户数据存储容量为23.31 GB，则纠错块个数为383 911(23.31 GB/64 kB)个，即LDC和BIS参数个数均为383 911.图2(a)为光盘纠错软件输出的BIS分布图，横轴为蓝光光盘的逻辑位置(GB)，纵轴为BIS校验码数。其中，5个信号特征峰是生物阵列产生的错误数集合。从信号的局部放大图可以看出一个信号特征峰是由多个离散数据峰构成，每个离散峰的宽度为64 kB(图2(a)右图所示)。由于光盘背景引起的数据错误远小于生物阵列引起的错误，对于检测信号来说可忽略。为实现自动化检测分析，需数据处理程序自动识别特征峰峰位并对特征信号中的离散数据进行积分。识别过程如图2(b)所示，原始数据经过数据量均值缩减、多次包络运算、自动阈值计算和阈值分割后，计算出每个信号特征峰的起始和结束位置，从而实现信号识别、定位、分割。

1.2.2墨点阵列的制备与读取

使用Blu-ray Disc Suite刻录软件(讯连科技有限公司)将约23.31 GB数据刻录到空白蓝光光盘上，使之没有空闲容量。将光盘进行紫外臭氧处理15 min后，使用喷墨打印机的配套设计软件Print CD设计打印图案并控制喷墨打印机在蓝光光盘上打印墨点阵列。然后将打印后的光盘放入烘干箱干燥。本文设计了尺寸不同、灰度一致的墨点阵列和尺寸一致、灰度不同的墨点阵列。使用移植到嵌入式系统的光盘质量诊断软件QPxTool的Error Correcttion功能对光盘进行纠错扫描，扫描速度为4倍速。

1.2.3生物素-链霉亲和素反应阵列的制备与读取

刻录数据后，将光盘浸泡在浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液中并放置于(55±1)℃干燥箱中进行内酯水解反应，水解1.5 h后彻底冲洗光盘表面并用氮气吹干。然后在光盘反应区铺设活化液(将100 mmol/L EDC+25 mmol/L NHS加入到pH值为5.8的MES溶液中混合而成)，4 h后冲洗干净并将PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流体通道模板贴在活化区域。向微通道注入biotin溶液(1 mg/mL)，固定8 h后注入buffer1(将150 mmol/L NaCl+4% BSA加入到pH值为7.4的PBS中混合而成)，封闭3 h后注入buffer2(150 mol/L NaCl+0.8% BSA+0.1% Gelation+0.05% Tween-20，百分数为质量分数)，封闭1 h.将不同浓度的纳米金-链霉亲和素结合物溶液依次注入不同通道，反应1 h后揭掉PDMS模板，使用buffer1封闭1 h.冲洗过后使用银染液(48 mmol/L硝酸银+182 mmol/L对苯二酚)对反应区域银染5 min，彻底冲洗光盘并用氮气吹干后，将光盘放入开发的嵌入式生物分子检测仪器中，操作软件系统进行光盘上链霉亲和素浓度的定量检测分析。

图2 特征信号自动化处理过程

2 结果与讨论

2.1 嵌入式平台生物分子检测可行性分析

光盘质量诊断软件输出LDC和BIS两种规范的光盘纠错数据，LDC模式下检测信号具有更高的信噪比，但当分析物浓度较高时检测信号容易达到饱和，因此一般选用BIS纠错数据作为定量检测的分析参数[15]。在ARM开发板上搭建完成嵌入式底层环境和QT图形环境后，将修改后的QPxTool软件交叉编译并移植到目标板平台运行。为验证该软件在嵌入式平台下用于生物分子检测的可行性，通过喷墨打印实验进行测试，并与Windows平台下PlexUtilities软件的扫描结果进行对比。在蓝光光盘表面打印了一组灰度相同(均为0)，直径分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mm的圆形墨点阵列。如图3(a)所示为PlexUtilities对墨点光盘的BIS纠错结果，8个特征信号与墨点的物理位置一一对应。图3(b)为嵌入式平台下QPxTool的BIS纠错结果，横坐标为蓝光光盘的逻辑位置(GB)，纵坐标为BIS校验码数。纠错结果中出现了8个与PlexUtilities结果中相同趋势且明显高于背景的特征信号：随着墨点直径增加，特征信号的幅值和宽度均增加。图3(c)中建立BIS错误总数与墨点面积的关系曲线，两者之间呈现出良好的线性关系，线性拟合方程为y=3 208.272 6x+48.807 1，线性拟合系数R2=0.993 7.由实验结果可知，QPxTool的光盘质量诊断功能在嵌入式Linux平台下可以用于光盘上生物分子的检测，且可以明显检测到直径为0.1 mm的墨点，表明了本检测系统的横向分辨率在100 μm以下。

图3 不同尺寸墨点阵列纠错扫描结果分析

为进一步验证该软件在嵌入式平台下用于生物分子检测的可行性，对尺寸相同灰度不同的墨点阵列进行了检测分析。打印了灰度值分别为240，210，180，150，120，90，60，30，0，直径均为1 mm的圆形墨点阵列。图4(a)为该墨点阵列光盘在PlexUtilities软件中的纠错扫描结果，墨点颜色随着灰度值减小而逐渐加深，且墨点位置在物理位置上与扫描结果中的信号特征峰完全对应。图4(b)为该墨点阵列光盘在嵌入式平台下使用QPxTool软件的纠错扫描结果，信号趋势和峰值与图4(a)基本一致：当灰度值大于180时，因墨点干扰而产生的BIS错误太小而被淹没于背景噪声，无明显信号产生。当灰度值小于180时，随着墨点颜色加深，产生的信号幅值增加，宽度基本不变。BIS密度与墨点灰度关系如图4(c)，在180～90的灰度范围内，BIS错误密度近似线性增长，在90～0的灰度范围内，BIS错误密度增长趋于平缓。这是由于灰度值较小的墨点吸收了大部分激光，使BIS变化减慢。

图4 不同灰度墨点阵列纠错扫描结果

2.2 嵌入式检测系统的准确性分析—蓝光光盘表面生物素-链霉亲和素反应的定量检测

生物素-链霉亲和素之间具有高强度的非共价结合作用，常作为生物反应放大系统被用于生化检测分析中，本文通过该实验验证所开发嵌入式检测系统的准确性。基于蓝光技术的链霉亲和素检测实验中，当链霉亲和素质量浓度低于0.5 μg/mL时，BIS密度近似线性增长，当质量浓度达到0.6 μg/mL时检测信号达到饱和[15]。因此，本实验借助PDMS微通道在蓝光光盘上制备了三组链霉亲和素的生物反应条带，分别为6个标准样品(0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5 μg/mL)、2个待测样品(0.03，0.3 μg/mL，重复3次)。

将制备好的生物阵列光盘放入检测系统的蓝光光驱中，控制检测系统的光盘质量诊断功能模块进行纠错扫描。扫描完成后的光盘BIS错误分布图如图5(a)所示，出现了12个与链霉亲和素样品反应条带对应的BIS特征峰。随着链霉亲和素浓度的增加，银染条带还原聚集的银颗粒数目逐渐增多，对光驱激光扰动越强，从而产生的BIS校验错误越多。如图5(b)所示，使用数据处理模块对光盘BIS纠错数据进行处理，点击“Start”键，系统识别并显示出与12个样品对应的BIS特征峰信号。在对应的条带面积输入框和标准浓度输入框中输入与样品对应的参数后，计算出6个标准样品BIS密度分别为180，357，768，1 768，2 999，3 241，两组待测样品对应的BIS密度分别为320，384，429和2 057，2 158，2 345.如图5(c)所示，切换到曲线拟合模块界面，根据标准样品浓度和与其对应的BIS密度生成标准曲线，继而计算出两组待测样品质量浓度均值分别为(0.033±0.007)μg/mL和(0.305±0.018)μg/mL.检测结果与待测样品的实际质量浓度0.03，0.3 μg/mL基本一致，说明所开发的嵌入式检测系统在实现便携性、自动化检测的同时保证了可靠的准确性。

图5 链霉亲和素检测分析

3 结论

本文提出了结合嵌入式技术的生物分子检测系统开发与定量检测方案，使用嵌入式Linux开发技术，完成了基于蓝光光盘/光驱技术的生物分子嵌入式检测系统与仪器的设计与开发，使标准光盘光驱成为专用性的生物分子检测设备，极大的方便用户使用。墨点实验表明本系统能够检测到光盘表面100 μm以下的阵列。通过生物素-链霉亲和素实验介绍了该检测系统的自动化检测分析流程并验证了检测结果的准确性，且所开发的仪器便携性好、操作简单，可作为医疗诊断、食品安全等应用场景下的即时检测分析工具。