伊犁河谷地区牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定与分析

摘要 為摸清伊犁河谷地区牛场牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染的病毒基因型，利用BVDV基因组5′端非翻译区（5′-UTR）通用型引物，采用一步法 RT-PCR对疑似感染样品进行基因扩增、序列测定与比对分析以及遗传进化树构建。结果显示：12份疑似样品中，有1份样品PCR扩增结果呈阳性，基因型鉴定为BVDV2型。该研究表明伊犁河谷规模化牛场内存在BVDV2型感染，为该地区规模化牛场病毒性腹泻病的防控提供了理论依据。

关键词 伊犁河谷;BVDV;基因型;鉴定

中图分类号 S852.65+3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）04-0082-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.021

Genotype Identification and Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus in Yili Valley Area

WANG Chuan-feng

（Yili Vocational and Technical College， Yining， Xinjiang 835000）

Abstract In order to find out the genotype of BVDV infection in cattle farms in Yili Valley area，using a universal primer for the 5′-UTR of the BVDV genome，gene amplification，sequencing and blasting，phylogenetic tree construction were conducted on suspected infection samples by one-step RT-PCR. The results showed that 1 of 12 suspected samples was PCR positive， and the genotype was identified as BVDV2. The results of the study indicated that there was BVDV2 infection in large-scale cattle farms in the Yili Valley，which provided theoretical basis for the prevention and control of BVD in large-scale cattle farms in this area.

Key words Yili Valley;BVDV;Genotype;Identification

基金项目 新疆维吾尔自治区高校科研计划项目（XJEDU2016S094）。

作者简介 王传锋（1982—），男，安徽淮南人，副教授，硕士，从事预防兽医学研究。

收稿日期 2020-06-30

牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属，主要引起牛病毒性腹泻[1]。依据BVDV保守端基因5′-UTR序列的差异性，可将病毒分为2种基因型，即BVDV1和BVDV2。其中，国内外已对BVDV1进行了广泛研究，许多经典菌株和常见的疫苗菌株都属于该基因型。BVDV1型感染牛常常表现出发热、腹泻和黏膜溃烂等症状;BVDV2型感染牛通常发病较急，临床表现主要为高热、下痢、血小板减少症、黏膜出血、呼吸困难并伴有流产和高死亡率[2]。感染BVDV的患畜，病毒存在于血清、冻精和胚胎中，以此为原料生产的生物制品将会给牛场和生物制品制造企业造成巨大的经济损失。Olafson 等[3]首次在感染牛肠道及排泄物中发现BVDV。目前，该疾病在世界范围内流行，尤其是在发达国家规模化牛场中。近年来，新疆牛病毒性腹泻病的流行形式也发生了一定的变化，由原来较多见的隐性感染和散发性病例演变为现今的地方性流行和暴发，加上BVDV基因型的多样性、免疫耐受性以及在患畜体内产生的持续性感染给防控该病带来了一定的困难。笔者采用一步法RT-PCR技术从采集的疑似病料（肛拭子）中扩增目的片段，并进行 BVDV基因分型鉴定，以期掌握伊犁河谷地区规模化牛场 BVDV 流行株的基因型，分析此基因型与国内外其他地区BVDV病毒株之间的关系，为防控该病提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

伊犁河谷地区部分规模化牛场，采集疑似犊牛腹泻样品（肛拭子）共12份，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂与仪器设备

1.2.1 主要试剂。

RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京鼎国生物科技有限公司;高纯质粒小量制备试剂盒购自百泰克生物技术（北京）有限公司;PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit生物制剂购自TaKaRa 生物工程有限公司。

1.2.2 主要仪器与设备。PCR扩增仪（型号T100，美国Bio-Rad公司）;全自动凝胶成像系统（型号K8300，南京世研仪器设备有限公司）;凝胶电泳仪（型号DYCP-44N，北京六一生物科技有限公司）;电泳仪电源（DYY-5D型，北京六一生物科技有限公司）;低温高速离心机（型号5418R，德国Eppendorf公司）。

1.3 引物

根据已知牛病毒性腹泻病毒5′-UTR特异性通用型引物扩增目的基因，预估扩增片段大小为267 bp，引物由北京鼎国生物科技有限公司合成。上游引物（5′-UTR-F）为5′-CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′，

下游引物（5′-UTR-R）为5′-GGAACTCCATGTGCCATGTACA-3′。

1.4 BVDV参考毒株

试验所用参考株序列均来源于GenBank数据库，具体如表1所示。

1.5 总RNA提取

参照RNA提取试剂盒使用说明书中的方法对12份检测样品进行总RNA提取。

1.6 一步法RT-PCR扩增

以疑似样品中提取的总RNA为模板，根据PrimeScriptTM OneStep RT-PCR Kit 试剂盒使用说明书进行RT-PCR扩增。具体反应体系如下：总RNA模板10 μL，5′-UTR-F 1 μL，5′-UTR-R 1 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，RNase Free ddH2O 11 μL，总体积为50 μL。具体RT-PCR 反应条件如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 5 min，95 ℃ 35 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，共32个循环;72 ℃延伸10 min。最后，将RT-PCR扩增产物置于1.0%瓊脂糖凝胶中进行电泳，并观察电泳结果。

1.7 目的基因的克隆与序列测定

收集凝胶电泳目的条带，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行纯化，将纯化后的目的基因与pMD18-T载体进行连接，并转化至Escherichia  coli DH5α感受态细胞。对重组质粒进行培养，挑取白色菌落开展PCR鉴定。用高纯质粒小量制备试剂盒提取重组质粒DNA，经酶切鉴定后将阳性重组质粒DNA送交北京鼎国生物科技有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR 扩增结果 对RT-PCR 扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示12份疑似样品中有1份样品扩增出约267 bp的条带，与预期的目的基因大小相符（图1）。

2.2 核苷酸序列同源性比较

将获得的目的基因测序结果与GenBank数据库中的参考毒株进行BLAST比对分析，结果显示测序基因序列属于BVDV，命名为BVDV-YL1。将BVDV-YL1与19个参考株进行核苷酸同源性比较（图2），结果显示BVDV-YL1与中国新疆XJ04株和BVDV2-125C株核苷酸同源性分别为96.4%和96.0%，与 BVDV1参考株核苷酸同源性为37.6%～77.9%。测序结果表明，BVDV-YL1属于BVDV2型毒株。

2.3 BVDV-YL1 基因遗传进化树分析

根据BVDV的5′-UTR 基因核苷酸序列同源性分析，构建BVDV-YL1遗传进化树（图3）。结果显示，BVDV-YL1毒株与中国新疆XJ04株和BVDV2-125C株亲缘性较近，同属BVDV2型。

3 讨论

BVDV1型和BVDV2型的同源性约60%。其中，BVDV1可分为18个基因亚型（BVDV1a～BVDV1r）[4]，BVDV2 可分为BVDV2a、BVDV2b、BVDV2c和BVDV2d四种亚型[5]。基于RNA病毒具有较高的基因突变性，BVDV基因的更多新亚型将被发现。结果显示，病毒的亚型与流行区域密切相关。比如，BVDV在欧洲主要以BVDV1a、BVDV1b、BVDV1d、BVDV1e、BVDV1f等多种亚型和BVDV2型为主[6]，在北美国家主要以BVDV1b和BVDV2a型为主，日本主要以BVDV1a型的形式存在[7]。在国内，1980年李佑民等[8]首次从流产的胎儿脾脏中分离到BVDV，经鉴定为1b亚型。目前，我国主要存在BVDV1a、BVDV1b、BVDV1c和BVDV2型。1991年刘崇向等[9]首次在羔羊腹泻病料中检测到BVDV。王青青等[10]在新疆南疆地区规模化奶牛场内检测到BVDV1c的感染。蔡元庆等[11]在新疆石河子和伊犁地区对疑似患畜新鲜粪便检测发现存在BVDV1感染。王龙等[12]采用RT-PCR方法从新疆16个不同地区的21份样品中检测到17株为BVDV1型，4株为BVDV2型。李娜等[13]在新疆石河子地区64份牛全血样品进行BVDV检测，发现全部样品均为BVDV-1b感染。目前，相关研究人员已在新疆牛场中检测到BVDV1b 、BVDV2、BVDV1c、BVDV1q、BVDV1f和BVDV1型未知亚型，从而证实了BVDV在新疆范围内流行的多样性和复杂性。

新疆是我国重要的畜牧业生产基地之一，规模化牛场分别较广，BVDV的防控形势也日趋严重。该试验从伊犁河谷地区规模化牛场采集的12份疑似样品中检测出1份 BVDV 阳性样品。基因分型鉴定结果表明，BVDV-YL1 株与中国新疆XJ04株和BVDV2-125C株亲缘性较近，同属BVDV2型，从而证实伊犁河谷地区规模化牛场中存在 BVDV2型的感染，为该地区牛病毒性腹泻病的防控提供了重要的理论支撑。

参考文献

[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997.

[2] RIDPATH J F，BOLIN S R，DUBOVI E J.Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes [J].Virology，1994，205（1）：66-74.

[3] OLAFSON P，MACCALLUM A D，FOX F H.An apparently new transmissible disease of cattle[J].Cornell Vet，1946，36：205-213.

[4] YE ILBAGˇ K，FRSTER C，OZGR OZYIGˇIT M，et al.Characterisation of bovine viral diarrhoea virus（BVDV）isolates from an outbreak with haemorrhagic enteritis and severe pneumonia[J].Vet Microbiol，2014，169（1/2）：42-49.

[5] GIANGASPERO M，HARASAWA R，WEBER L，et al.Genoepidemiological evaluation of bovine viral diarrhea virus 2 species based on secondary structures in the 5′ untranslated region[J].J Vet Med Sci，2008，70（6）：571-580.

[6] BECHER P，ORLICH M，SHANNON A D，et al.Phylogenetic analysis ot pestiviruses from domestic and wild ruminants[J].J Gen Virol，1997，78（Pt6）：1357-1366.

[7] TAJIMA M.The prevalent genotypes of bovine viral diarrhea virus in Japan，Germany and the United States of America[J].Jpn J Vet Res，2006，54（2/3）：129-134.

[8] 李佑民，劉振润.吉林省某奶牛场暴发牛病毒性腹泻-粘膜病及其病毒分离的初步研究[J].中国人民解放军兽医大学学报，1981，1（3）：62-64，70.

[9] 刘崇向，王治才，沙吾列.羔羊腹泻病料牛病毒性腹泻病病毒检测[J].新疆农业科学，1991（6）：280-281.

[10] 王青青，张迎春，崔鑫，等.新疆南疆牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定及分析[J].畜牧与兽医，2018，50（7）：113-117.

[11] 蔡元庆，雷程红，包振中，等.新疆部分地区牛病毒性腹泻-黏膜病病毒的分离鉴定[J].新疆农业科学，2015，52（12）：2335-2343.

[12] 王龙，梁霄勇，季新成，等.新疆部分地区牛病毒性腹泻病毒的分离、鉴定及分子流行病学调查[J].新疆农业科学，2015，52（2）：334-338.

[13] 李娜，韩猛立，黄新，等.新疆石河子地区牛病毒性腹泻病毒的分子流行病学调查[J].石河子大学学报（自然科学版），2009，27（6）：706-711.