营养物质浓度和附着材料对微藻附着的影响
2020-10-30胡振张瑾贾伟
胡振，张瑾，贾伟
（合肥工业大学土木与水利工程学院，安徽合肥 230009）
近年来，人类不断发现各种各样的新能源[1]，随着研究的不断深入，这些新能源的优缺点也逐渐被人们所了解。其中，微藻作为光合微生物，具有生产周期短、生长繁殖快、可吸收水体中的营养物质进行新陈代谢并进行光合作用产出油脂等特点，在废水的处理和生物燃料的制备中被广泛研究应用。在这些研究中，微藻的捕获是制作生物燃料的的关键步骤，但由于其细胞的尺寸较小，且细胞因表面带负电而互相排斥[2]，从而使微藻回收成本过高，成为目前研究中的难点。本研究以小球衣藻为实验藻种，研究在不同营养条件和附着材料下，小球衣藻的附着行为，同时进行附着材料对营养物质吸附量的测定和微藻胞外聚合物分泌量的测定。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
硝酸钠，优级纯，国药；氢氧化钠、盐酸、氨基磺酸、硫酸、蒽酮，均为分析纯，国药；Lorry低蛋白试剂，上海荔达。
Centrifuge5804高速离心机，德国Eppendorf；UV2600紫外分光光度计，上海Unico；BDP-250 CO2二氧化碳人工气候箱，上海百典；KQ5200DE超声波清洗器，江苏昆山舒美；IX73+DP倒置显微镜，日本Olympus；LX-650-L高压灭菌锅，合肥华泰医疗。
1.2 实验方法
将培养至对数生长期的小球衣藻悬液加入离心管中，在2 000 g条件下离心10 min，弃去上清液，进行重悬，并再次离心；重复2次去除藻液中含有的亚硒酸盐富集培养基（SE培养基），即得到实验用小球衣藻悬液，在无菌环境下密封备用。
配置5瓶硝态氮溶液，溶液中硝态氮浓度分别为SE培养基中硝态氮浓度的1、1/2、1/10、1/50、1/100，同时设置浓度为0的溶液作为对照。放入高压灭菌锅内121 ℃条件下灭菌15 min后，加入试剂瓶中，每个浓度配置2瓶（A瓶、B瓶），将准备好的藻溶液加入各个试剂瓶中，并在试剂瓶中分别加入2 cm×2 cm的亲水性碳纸（Ⅰ瓶）或疏水性碳纸（Ⅱ瓶），1 h和8 h后取样分析藻类密度，每组实验设置3组平行样，每次实验重复3次，实验在二氧化碳人工气候培养箱中进行，设置培养箱温度为（25±1）℃，光照强度为2 000 lx，实验中持续光照。
1.2.1 分光光度法测定藻类密度
小球衣藻在680 nm波长处的吸收峰较高，用紫外分光光度计在680 nm波长下测定其吸光度并从校准曲线中查得相应的藻类密度，即为水样测定结果（cells/mL）；水样若经稀释后测定，则结果应乘以稀释倍数。
1.2.2 运动速度的测定
取30 μL藻液放在载玻片上使用倒置显微镜进行显微视频拍摄，并将其连接到计算机，使用cellSens Standard软件记录运动视频。每一组样品拍摄一段视频，使用Image J软件进行细胞追踪，将视频用连续截屏功能按照500 ms/张的频率进行截取，用Image J手动追踪藻细胞并进行位置标识，以计算其运动速度。每个视频中选取5个微藻的运动轨迹进行分析，每个微藻统计其20 s左右的平均运动速度。将小球衣藻在各个时间点的运动速度结果进行统计和归纳，并绘制出频率分布图和正态分布图。
2 结果与分析
2.1 营养条件对微藻附着的影响
分别在实验进行到1 h和8 h时，对碳纸上小球衣藻的附着量和溶液中小球衣藻的悬浮量进行统计，结果如图1所示。对溶液中的小球衣藻进行数量统计，如图1A、1B所示，发现在各营养条件和附着材料下，溶液中悬浮的小球衣藻相差不大。从图1C、1D可以看出，在1 h时，相同附着材料中，小球衣藻的附着量较接近；在8 h时，随着溶液中硝态氮浓度的增加，小球衣藻的附着量出现先上升后降低的趋势，并在营养限制性条件下（硝态氮浓度为1/10 SE）达到峰值，为（16.07±0.42）×104cells/cm2和（4.00±0.21）×104cells/cm2；且附着材料为亲水性碳纸时小球衣藻的附着量明显高于附着材料为疏水性碳纸时，最高附着量可达到其4倍左右。
图1 不同营养浓度下小球衣藻的悬浮量和附着量
图2 不同营养浓度影响下小球衣藻的运动速度
营养物质浓度对小球衣藻的附着有一定影响，尤其在硝态氮浓度为1/10 SE时促进作用较明显，且随着时间增加影响逐渐加大；附着材料对微藻的附着也有着显著影响。
2.2 不同营养物质下小球衣藻的运动速度
研究表明，微藻的运动速度也是影响其附着的重要指标之一，所以研究营养物质浓度对微藻运动速度的影响是很必要的。统计1 h和8 h时微藻的运动速度，并对其频率进行正态分布的非线性拟合，拟合结果如图2A、2C所示，将拟合后曲线中的速度期望进行整合，得到图2B、2D的期望值。从图中可以看出随着营养物质浓度的上升，小球衣藻的运动速度表现出先增加后降低的趋势，并在1/10 SE培养基的硝态氮浓度下，运动速度出现峰值点，分别达到（26.60±0.69）μm/s、（25.21±0.89）μm/s，这种规律与微藻的附着结果类似，说明限制性营养浓度对小球衣藻的运动速度有促进作用；随着运动速度的增加，微藻与碳纸的碰撞概率上升，进而促进了小球衣藻的附着
3 结论
营养物质浓度和附着材料对小球衣藻的附着都有一定的影响，在硝态氮浓度为1/10 SE时，小球衣藻的附着达到峰值；限制性营养浓度对小球衣藻的运动速度有促进作用，进而促进小球衣藻的附着。
