Cullin1对肺腺癌A549和H1395细胞生物学特性的影响

刘静怡 苏姗娜 何慧洁 王慧敏 张冬

肺癌是全球癌症死亡的主要原因[1]，随着工业化、城市化及环境污染肺癌病因也变得更加复杂，由于早期临床表现缺乏特异性，同时缺乏敏感的筛查指标，大部分患者明确诊断时已处于晚期，失去手术治疗的机会，同时放疗、化疗毒副作用较大，不能高度特异性地杀伤肿瘤细胞，且容易复发和远处转移，故患者的预后较差[2]。Cullin1蛋白是Cullin家族的一员，目前在人类基因组中，Cullin蛋白家族共有8个成员，Cullin1为SCF复合体（Skp1-Cul-F-box）的重要组成部分，可介导参与细胞周期进程中许多蛋白质的蛋白酶体的降解，一旦Cullin1的调节机制发生异常，SCF复合体功能也相应发生变化，使癌细胞发生积累或肿瘤抑制因子的过度降解，导致细胞的恶性转化和肿瘤发生[3,4]。近年来研究表明Cullin1与恶性肿瘤的生物学行为密切相关，已有研究表明在肾癌、乳腺癌、结肠癌中异常表达[5-7]，而肺癌中少有报道，本研究拟探讨Cullin1对肺腺癌A549和H1395细胞生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 肺腺癌细胞（A549、H358、H1395、H1650）及人正常肺上皮细胞BEAS-2B（中国科学院干细胞库），RPMI-1640培养基、0.25%胰酶（美国Hyclone公司产品）、胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），TRIzol试剂（上海Invitrogen公司），siRNA Cullin1（上海吉玛制药技术有限公司），Lipofectamine 2000转染试剂（赛默飞世尔科技公司），四甲基偶氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay, MTT）试剂（北京中杉金桥生物技术公司），Transwell（上海碧云天公司），基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）抗体、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）抗体、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1, TIMP-1）抗体、Cyclin D1抗体、Cyclin E2抗体、p21抗体、p27抗体（上海贝晶生物技术有限公司），逆转录试剂盒、实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）试剂盒SYBR Premix Ex Taq、细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和内参β-actin抗体（北京瀚海拓新生物技术有限公司）。

1.2 细胞培养 将肺腺癌细胞（A549、H358、H1395、H1650）及人正常肺上皮细胞BEAS-2B分别置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基和LHC-9培养基中，放置于37oC、5%CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 细胞株筛选 利用TRIzol分别提取肺腺癌细胞（A549、H358、H1395、H1650）和BEAS-2B细胞中RNA，按照逆转录试剂盒说明书将提取的RNA反转录成cDNA，根据实时定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq进行实验，以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算肺腺癌细胞和BEAS-2B中Cullin1 mRNA表达。选取表达量相对较高的两株肺腺癌细胞进行后续的干扰实验。

1.4 转染及分组 将选取的两株肺腺癌细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640的培养基中，放置于 37oC、5%CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板中，放置于37oC、5%CO2的细胞培养箱中培养过夜，待细胞培养至对数生长期时，采用瞬时转染，根据Lipo2000说明书，将siRNA转染入细胞中，在37oC、5%CO2培养箱中进行培养48 h，4 h-6 h换液。分为siRNA干扰组（si-Cullin1组）及对照组（未经转染的肺腺癌细胞，NC组）。

1.5 MTT法 取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化，置成细胞悬液，密度为2×104个/mL，按2,000个/孔接种于96孔板，置于37oC、5%CO2培养箱中培养，分别于第1、2、3、4、5天取出96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL，继续在培养箱中避光孵育4 h，弃去孔内的培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速震荡10 min，在酶标仪上测定各孔在490 nm处的OD值。

1.6 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期的细胞，用PBS清洗2遍，加入胰酶适度消化细胞，离心5 min，用预冷的PBS重悬细胞，加入预冷的70%乙醇，吹打均匀，放入4oC冰箱固定过夜，离心，弃去上清液，用预冷的PBS洗2遍，加入100 μL RNase A，于37oC孵育30 min，再加入400 μL PI并充分混匀，4oC下避光培养30 min，应用细胞流式仪分析细胞周期。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，用PBS洗涤2次，加入胰酶消化，1,000 rpm，离心5 min，弃上清液，将细胞重悬于500 μL的Binding Buffer后，再加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，加入5 μL PI染色，避光条件下反应15 min，在流式细胞仪下进行检测。

1.8 Transwell侵袭实验 取对数生长期的细胞，调整细胞数为3×104个/mL；在上室内均匀的覆盖稀释好的Matrigel基质胶，在24孔板的底部加入500 μL含10%的胎牛血清的培养基，每孔加入200 μL的细胞悬液，继续在37oC、5%CO2的培养箱中孵育24 h后取出上室，擦净，将上室加入800 μL的甲醇，室温下固定30 min，用台盼蓝进行染色，上室底部朝上晾干，放置在倒置显微镜下计数。

1.9 Transwell迁移实验 取对数生长期的细胞，调整细胞数为2×104个/mL，在24孔板的底部加入500 μL含10%的血清的培养基，在上室中加入200 μL的细胞悬液，继续在37oC、5%CO2的培养箱中孵育24 h，擦净，固定，染色，计数方法同前。

1.10 Western blot 胰酶消化、离心、加入蛋白酶抑制剂以及RIPA裂解液，离心取上清液于EP管中，提取总蛋白，用二奎啉甲酸法（BCA法）测定蛋白浓度；取40 μg蛋白以10%SDS-PAGE电压为100 V，电泳90 min，分离后转到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗，4oC冰箱孵育过夜；第二日，室温下复温30 min，用TBST洗涤3次，5 min/次，加入二抗，室温下孵育2 h，孵育好后，洗涤方法同上，利用Odyssey红外荧光扫描，以β-actin为内参。

1.11 统计学方法 采用统计软件SPSS 23.0统计软件进行分析，数据结果以均数±标准差（Mean±SD）表示，组间差异比较采用t检验进行分析；检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义，统计图使用GraphPad 8.0软件绘制。

2 结果

2.1 Cullin1在肺腺癌细胞株及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的表达 采用实时定量PCR检测肺腺癌细胞（A549、H358、H1395、H1650）及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中Cullin1 mRNA的表达水平，以人正常肺上皮细胞BEAS-2B为参照，Cullin1 mRNA在肺腺癌细胞中均呈高表达，在肺腺癌A549和H1395细胞中的表达相对较高，差异有统计学意义（P＜0.05），因此选取这两株肺腺癌细胞进行后续的实验（图1）。

2.2 MTT实验 肺腺癌A549和H1395细胞经过转染后，第4天开始si-Cullin1组A549和H1395细胞OD值低于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05），第5天si-Cullin1组A549和H1395细胞OD值明显低于NC组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2）。

2.3 干扰Cullin1后对细胞周期的影响 与NC组比较，si-Cullin1组A549和H1395细胞处于G1期的细胞增多，S期细胞减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3A、图

3B）。

2.4 干扰Cullin1后对细胞早期凋亡的影响 与NC组比较，si-Cullin1组A549和H1395细胞早期凋亡率增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3C、图3D）。

2.5 Transwell细胞侵袭实验 肺腺癌A549和H1395细胞经Cullin1 siRNA转染后，与NC组相比，穿过Transwell小室的细胞数分别下降57%、42%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4A、图4B）。

图 1 qRT-PCR检测肺腺癌细胞（A549、H358、H1395、H1650）及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中Cullin1 mRNA的表达。与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比：*P＜0.05。Fig 1 The expression of Cullin1 mRNA in lung adenocarcinoma cells (A549, H358, H1395, H1650) and human normal lung epithelial cells BEAS-2B by qRT-PCR. Compared with human normal lung epithelial cells BEAS-2B: *P＜0.05. qRT-PCR: quantitative real time polymerase chain reaction.

2.6 Transwell细胞迁移实验 肺腺癌A549和H1395细胞经Cullin1 siRNA转染后，与NC组相比，穿过Transwell小室的细胞数分别下降52%、35%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4C、图4D）。

图 2 MTT法检测干扰Cullin1后对肺腺癌A549（A）和 H1395（B）细胞增殖的影响。*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 2 The effect of interference with Cullin1 on proliferation of lung adenocarcinoma A549(A) and H1395(B) cells was detected by MTT assay . *P＜0.05, **P＜0.01. OD: optical density; MTT: methyl thiazolyl tetrazolium assay.

2.7 CyclinD1、CyclinE2、p21、p27蛋白表达水平 与NC组相比，肺腺癌A549细胞CyclinD1蛋白表达水平下降55%，CyclinE2蛋白表达水平下降53%，而p21蛋白表达增加30%，p27蛋白表达增加34%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5A、图5B）。而H1395细胞CyclinD1蛋白的表达水平降低了39%，CyclinE2蛋白的表达水平降低了48%，差异有统计学意义（P＜0.05），而p21蛋白表达增加25%，p27蛋白表达增加31%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5C）。

2.8 干扰Cullin1对MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白水平的影响 与NC组相比，肺腺癌A549细胞的MMP-9蛋白表达水平降低48%，MMP-2蛋白表达水平降低60%；而TIMP-1蛋白表达增加78%，差异有统计学意义（P＜0.05） （图6A，图6B）。H1395细胞MMP-9蛋白表达水平降低16%，MMP-2蛋白表达水平降低52%（P＜0.05），TIMP-1蛋白表达增加38%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图6C）。

3 讨论

近几年，随着肺腺癌相关基因研究不断深入，许多有关肺腺癌生长和发展的基因被发现，更多的治疗方法也不断出现[8,9]。Cullin1蛋白是Cullin家族功能最广泛的成员，是SCF复合体的一种支架蛋白，可以调节多种蛋白因子，如p21、p27和p53等，同时也参与调节细胞周期、信号转导和转录等过程。关于Cullin1与恶性肿瘤之间的研究也越来越多，Min等[10]研究发现乳腺癌中Cullin1的表达与预后因素如组织学分级高及p53蛋白表达相关，与治疗标志物如ER阴性、HER2阳性密切相关，Cullin1高表达与总生存率低显著相关，同时Cullin1调节乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Bai等[11]发现干扰Cullin1后可以使胃癌细胞增殖能力下降，将细胞周期阻滞在G1期，可以降低细胞黏附能力，而癌细胞黏附于靶组织是癌转移侵袭和迁移的关键步骤。Liu等[12]发现Cullin1高表达与肝癌的TNM分期及不良预后相关。研究发现Cullin1的高表达可使大肠癌细胞停滞在细胞周期G1期，同时能够促进肿瘤的增殖和侵袭，Cullin1高表达与结肠癌淋巴结转移及不良预后有关[13,14]。

图 3 流式细胞术检测干扰Cullin1后对肺腺癌A549和H1395细胞周期及早期凋亡的影响。A：流式细胞术检测细胞周期；B：肺腺癌A549和H1395细胞周期的柱状图比较；C：流式细胞术检测细胞早期凋亡数量；D：肺腺癌A549和H1395细胞早期凋亡率的柱状图比较。*P＜0.05。Fig 3 Flow cytometry to detect the effect of interference with Cullin1 on the cell cycle and early apoptosis of lung adenocarcinoma A549 and H1395. A: Flow cytometry to detect cell cycle; B: Comparison of lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells cycle histograms; C: Flow cytometry to detect the number of early apoptosis; D: Comparison of histograms of early apoptosis rate of lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells. *P＜0.05.

肿瘤细胞的主要特征是有较高的增殖能力，且远远超过正常细胞[15]。在本研究中，实时定量PCR结果显示肺腺癌细胞（A549、H358、H1395、H1650）中Cullin1 mRNA表达水平较人正常肺上皮细胞BEAS-2B增高，尤其在肺腺癌细胞A549和H1395中最显著，后续实验采用肺腺癌A549和H1395细胞进行。通过MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖、细胞周期及早期凋亡情况，结果发现干扰Cullin1表达后，肺腺癌A549和H1395的增殖能力受到明显的抑制，G1期细胞数量较对照组明显增加，S期细胞数量减少，细胞早期凋亡率明显增加，干扰Cullin1表达后可使细胞周期进程停滞在G1期，从而抑制了细胞的增殖。细胞异常的增殖通常与细胞周期的调节相关，主要与细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent protein kinases, CDKs）有关，CDKs是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员，在控制细胞分裂和调节转录方面发挥着重要作用，其活性主要受细胞周期蛋白调控[15]。细胞周期蛋白属于一个传统保守的蛋白家族，在特定的细胞周期阶段表达，从而调节CDKs的活性[16]。有文献[17]报道细胞周期蛋白D（Cyclin D）、细胞周期蛋白E（Cyclin E）或者细胞周期蛋白A（Cyclin A）和CDKs形成的复合物可促进细胞周期进程。p21和p27是细胞周期蛋白依赖性激酶家族的成员，它们通过阻止细胞从G1期进入S期而发挥抑癌作用，p21和p27的功能是抑制Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表达水平[18,19]。Cullin1通过泛素化蛋白水解系统调节Cyclin D1、Cyclin E2及CDKs抑制剂p21和p27的表达，该蛋白水解系统失调可能导致增殖失控[20]。本研究通过Western blot实验结果发现，Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表达量减少，而p21和p27蛋白表达量增多，表明干扰Cullin1后导致泛素-蛋白酶体系统功能障碍，p21和p27蛋白的积累进一步导致Cyclin D1和CyclinE2蛋白表达量减少。Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表达量的减少，使肺腺癌细胞从G1期向S期转变的进程受到影响，细胞周期停滞，从而抑制了细胞的增殖。

图 4 Transwell实验检测干扰Cullin1后肺腺癌A549和H1395细胞侵袭及迁移的能力。A：侵袭实验检测穿过基底膜细胞数量；B：肺腺癌A549和H1395细胞侵袭率的柱状图比较；C：迁移实验检测穿过基底膜细胞数量；D：肺腺癌A549和H1395细胞迁移率的柱状图比较。*P＜0.05。Fig 4 The ability of invasion and migration of lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells was detected by Transwell experiment after interference with Cullin1. A: The invasion experiment detected the number of cells passing through the basement membrane; B: Histogram comparison of cell mobility in lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells; C: The migration experiment detected the number of cells passing through the basement membrane; D: Histogram comparison of cell mobility in lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells. *P＜0.05.

肿瘤的转移是在一系列复杂的细胞侵袭-转移级联上完成的，通过周围环境侵入局部的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）和基质细胞层，在转移部位重新启动增殖程序，从而造成肿瘤的发生[21]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）属于锌依赖性内肽酶家族，主要作用是破坏ECM，同时使肿瘤血管生成增加[22]，肿瘤间质中MMPs水平升高与肿瘤细胞浸润或转移呈正相关[23]。MMP-2和MMP-9属于MMPs家族成员，主要作用是降解基底膜和ECM的基本成分IV型胶原，从而促进肿瘤细胞的转移，特别是MMP-2被认为在肿瘤侵袭的初始步骤中起着重要作用；MMP-9在肿瘤的侵袭、转移和血管生成中发挥作用，并介导肿瘤微环境的改变[24,25]。TIMPs是MMPs的天然抑制剂，现已有四位家族成员，分别为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，其家族成员均能与MMPs形成1:1的共价复合物，抑制MMPs的活性。TIMP-1不仅有抑制MMPs活性的功能，还参与多种生物学活动，包括细胞分化、生长、迁移、侵袭、血管生成和凋亡[26]。本研究通过细胞侵袭和迁移实验，发现干扰Cullin1后两种肺腺癌细胞（A549和H1395）的侵袭和迁移能力都出现了明显的下降；为了进一步研究其机制，通过Western blot实验结果发现si-Cullin1组细胞的MMP-9、MMP-2的蛋白表达量较对照组下降，而TIMP-1蛋白表达量则增加，这可能是由于TIMP-1蛋白表达的上调抑制了MMP-9、MMP-2活性有关，从而导致侵袭和迁移能力的下降。

图 5 Western blot检测Cyclin D1、Cyclin E2、p21和p27在肺腺癌A549和H1395细胞中的蛋白表达含量。A：Western blot验证CyclinD1、CyclinE2、p21和p27表达；B：肺腺癌A549细胞中相对灰度值表达比较柱状图（*P＜0.05）；C：肺腺癌H1395细胞中相对灰度值表达比较柱状图。*P＜0.05。Fig 5 Western blot was used to detect the protein content of Cyclin D1, Cyclin E2, p21 and p27 in lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells. A: Western blot to verify the protein expression of Cyclin D1, Cyclin E2, p21 and p27; B: The histogram of relative gray value expression comparison in lung adenocarcinoma A549 cells (*P＜0.05); C: The histogram of relative gray value expression comparison in lung adenocarcinoma H1395 cells. *P＜0.05.

综上所述，本研究发现Cullin1在肺腺癌细胞中高表达，干扰Cullin1能明显阻滞肺腺癌细胞的增殖，使细胞周期停滞于G1期，同时使肺腺癌细胞侵袭及迁移的能力降低，提示Cullin1可能作为肺腺癌治疗新的潜在靶点。

Author contributions

Liu JY and Zhang D conceived and designed the study. Liu JY, and Su SN performed the experiments. Wang HM and He HJ analyzed the data. Liu JY and Zhang D contributed analysis tools. Liu JY and Zhang D provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

图 6 Western blot检测MMP-9、MMP-2和TIMP-1在肺腺癌A549和H1395细胞中的表达蛋白的含量。A：Western blot验证MMP-9、MMP-2和TIMP-1表达；B：肺腺癌A549细胞中相对灰度值表达比较柱状图；C：肺腺癌H1395细胞中相对灰度值表达比较柱状图。*P＜0.05。Fig 6 Western blot was used to detect the protein content of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1 in lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells. A: Western blot to verify the protein expression of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1; B: The histogram of relative gray value expression comparison in lung adenocarcinoma A549 cells; C: The histogram of relative gray value expression comparison in lung adenocarcinoma H1395 cells . *P＜0.05. MMP: matrix metalloproteinase; TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinase.