甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系160S花药败育的形态学特征和细胞学研究

唐 鑫 李圆圆 陆俊杏 张 涛

重庆师范大学生命科学学院, 重庆 401331

油菜作为世界上重要的油料作物之一, 是食用油和生物燃料的重要来源[1]。为了满足日益增长的需求, 提高油菜产量是育种工作急需解决的问题和长期目标。雄性不育植物是杂交育种所必需的育种材料, 能利用杂种优势来提高作物产量, 在农业生产上具有重要的经济价值[2-3]。

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)和细胞核雄性不育(genic male sterility, GMS)已被广泛应用于油菜杂种优势的开发与利用, 其中, GMS类型主要分为受光周期影响的光敏型雄性不育(photoperiod-sensitive genic male sterility, PGMS)和受温度控制的温敏型雄性不育(thermo-sensitive genic male sterility, TGMS)[4-5]。由于大多数 P/TGMS由隐形核基因控制, 雄性不育基因容易遗传, 可以用作父本, 具有恢复源广、细胞质来源丰富等优点, 被认为是两系杂交育种的高效系统[6]。目前, 已发现的甘蓝型油菜PGMS类型主要有H90S、N196S和501-8S;TGMS类型主要有Xiangyou 91S、Xiangyou 402S、Huiyou 50S、373S、SP2S、104S、TE5A 等[7]。自首次报道水稻光敏不育系 58S, 并成功用于水稻两系杂交育种以来[8],在禾本科[9-11]、豆科[12]和十字花科[13]等其他植物中也发现了光温敏雄性不育系材料。近年来, 甘蓝型油菜雄性不育材料花药的细胞学特征显微观察已得到广泛的关注。Sun等[7]研究发现, 373S花粉败育是由于小孢子在发育过程中出现细胞质浓缩、胞外壁不规则、单核后期绒毡层降解异常引起的。李可琪等[14]和 Yan等[15]观察TE5A的花药切片发现, 在减数分裂期花粉母细胞同源染色体不能配对、凝聚形成二分体和四分体, 导致小孢子发育受阻, 最终引起败育。Yu等[16]对SP2S细胞学观察发现, 绒毡层细胞在减数分裂早期高度空泡化变大, 小孢子无法从四分体释放出来, 并伴随胼胝质降解异常, 最终导致败育。总之,植物雄性不育是一个极其复杂的过程, 败育时期、方式多种多样, 败育特征和程度也各不相同。

前期研究表明[17], 160S育性受环境温度影响, 20℃以下可育(160S-MF), 25℃以上不育(160S-MS); 温度是影响育性的关键因素, 随着温度的升高, 花粉活力、角粒数和结角率随之降低; 研究还表明, 160S具有恢复源广泛、较强的一般配合力、杂种优势明显等优点, 可以应用培育杂交油菜新品种。前人仅仅开展了温度对不育系160S育性转化和杂种优势等方面的研究, 但其败育时期、原因和细胞学特征尚未报道。本研究通过观察甘蓝型油菜160S-MF和160S-MS形态学和细胞学差异, 明确160S-MS败育的时期和细胞学特征, 初步解析其败育原因, 旨在为深入研究其雄性不育内在分子调控机理以及在杂种优势的利用等方面奠定基础, 同时对甘蓝型油菜两系杂交育种具有指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系160S种子由重庆师范大学油用牡丹种质资源创新与利用重点实验室保存。在室温(20℃)条件下播种, 10 d后将长势良好的幼苗移栽至直径20 cm的花盆中, 一盆一株苗, 春化处理后, 分别放置在温度为 15℃和 28℃的冷光源植物生长箱(赛福ZRX-1100E)中培养, 光照16 h/黑暗8 h, 湿度50%。

1.2 取材与固定

在初花期, 取160S-MF、160S-MS不同大小花蕾的花药压片, 用 1%醋酸洋红染色, 在荧光显微镜(SOPTOP RX50)下观察小孢子发育时期。采样后, 将样品分组放入FAA固定液(50%酒精90 mL、冰醋酸5 mL、37%甲醛5 mL)中, 真空干燥箱(SKK ZK-50)抽真空, 直至花蕾完全沉入瓶底, 室温固定24 h, 70%乙醇4℃冰箱存放备用。

1.3 花器形态特征观察

分别采集160S-MF、160S-MS盛花期的30朵花朵, 用游标卡尺测量花冠径、花瓣长、花瓣宽、雌蕊长、四强雄蕊长、二弱雄蕊长、四强花药长、花丝长和花柄长等花器性状。采用Microsoft Excel 2007处理数据, 用统计软件SPSS 20.0分析所测数据。体式显微镜(励扬LY-WN-OPLENIC)观察花朵形态并照相。

1.4 花药石蜡切片观察

采用常规石蜡切片方法, 用70%、85%、95%和100%梯度乙醇溶液脱水, 二甲苯透明, 石蜡浸蜡和包埋, 切片厚度6～8 μm, 郝伯特配方粘片剂粘片, 苏木精-伊红染色,中性树胶封片, 待胶完全凝固后, 在荧光显微镜(SOPTOP RX50)下观察并照相。

1.5 TUNEL染色

采用Dead End Fluorometric TUNEL System (Promega)试剂盒方法检测细胞凋亡。花药石蜡切片用二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水洗涤, PBS洗涤5 min, 4%多聚甲醛溶液固定15 min, 然后用20 μg mL-1蛋白酶K室温孵育10 min,加rTdT孵育缓冲液(Equilibration Buffer, Nucleotide Mix,rTdT)对核 DNA片段进行脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记,37℃避光孵育60 min。用碘化丙啶(PI, Sigma)复染。使用荧光显微镜(SOPTOP RX50)观察。在(520 ± 20) nm处观察荧光素的绿色荧光(TUNEL信号); 在＞620 nm处观察碘化丙啶的红色荧光。

2 结果与分析

2.1 160S-MF和160S-MS花朵形态学分析

对比观察160S-MF (15℃)、160S-MS (28℃)花朵的形态发现, 两者在外观形态上有明显差别, 160S-MF花朵较大(图1-A), 雄蕊长度高于雌蕊(图1-B), 花药呈黄色, 形态饱满, 能正常开裂, 释放出有活性的花粉; 160S-MS能正常开花, 花朵呈浅黄色(图1-D), 雄蕊 6枚, 四强二弱,但花朵整体偏小, 雄蕊长度不及雌蕊1/2 (图1-E), 花药褐黄色呈小三角形, 干瘪萎缩, 无花粉。160S-MS的花器形态也发生显著变化(表1)。在所测的花器特征参数中, 除雌蕊和萼片外其余花器官都达到极显著水平。与160S-MF相比, 160S-MS花瓣长度、宽度显著性变小、变窄(图1-C, F), 雄蕊(四强雄蕊和二弱雄蕊)明显退化, 花药和花丝极显著短于可育株的花丝和花药。

表1 160S-MF和160S-MS的花器性状比较Table 1 Comparison of the flower traits between 160S-MF and 160S-MS (mm)

2.2 160S-MF和160S-MS小孢子形态观察分析

通过对 160S-MF、160S-MS不同发育阶段小孢子发育的细胞学观察, 研究了花药败育的特征, 如图所示, 跟大多数植物一样, 160S-MF花粉母细胞经2次减数分裂后形成四分体结构(图2-A), 周围有胼胝质; 随着胼胝质解体后, 进入单核早期(图2-B), 四分体慢慢释放出圆形的单个小孢子, 形态较小, 未明显观察到细胞核; 单核靠边期(图2-C), 明显能观察到细胞核移向细胞一侧, 此时的细胞核形态清晰, 整个细胞呈三瓣状; 之后, 随着小孢子继续发育, 细胞核经一次有丝分裂(图2-D), 形成一大一小2个细胞核, 这时进入双核期, 营养核较大位于细胞中央, 靠近细胞壁一侧较小的细胞核为生殖核; 小孢子继续发育至成熟期(图2-E), 花粉粒染色后整体颜色较深, 细胞核不能明显辨别, 形态饱满接近圆形。对160S-MS花药染色压片, 并未观察到小孢子或者花粉粒(图2-F), 表明花药很有可能在小孢子形成前就已败育。

2.3 160S-MF和160S-MS花药细胞学观察

对 160S-MF花药切片观察发现, 在造孢时期, 造孢母细胞紧密地排列在药室中央, 细胞核清晰可见, 形态呈不规则多边形(图3-A); 随着花药的发育, 造孢母细胞间稍微分开, 此时花药壁由表皮、药室内壁、中层组成, 绒毡层的发育不是很清楚(图3-B); 进入花粉母细胞时期,花粉母细胞进一步发育, 体积变大, 形状呈椭圆形, 绒毡层细胞整齐地排列在花药壁最内层, 呈长方形, 清晰可见(图3-C); 减数分裂期(图3-D), 有的花粉母细胞有两团染色质, 表明其在进行核分裂, 此时, 绒毡层细胞处于双核状态; 四分体时期(图3-E), 小孢子呈四面体型, 绒毡层开始出现降解趋势; 小孢子细胞核靠近细胞一侧, 此时进入单核晚期, 小孢子的花粉壁开始增厚(图3-F); 双核期的小孢子细胞壁逐渐加厚且趋于圆球形, 绒毡层持续降解(图3-G); 成熟花粉期, 绒毡层不复存在, 花粉粒呈椭圆形, 形态饱满, 染色后变深(图3-H), 4个花粉囊呈蝴蝶型, 花粉囊开裂, 释放出花粉(图3-I)。

对 160S-MS花药切片观察发现, 花药也能分化形成蝴蝶型排列的4个花粉囊(图4-A)。160S-MS在造孢时期和花粉母细胞时期与160S-MF无明显差异(图4-B, C), 造孢细胞和花粉母细胞发育均正常, 此时组成花药壁的各组织结构在形态和发育也无异常。减数分裂期(图4-D, E),160S-MS花药绒毡层发育出现异常, 尽管绒毡层为双核细胞, 但与同一时期的160S-MF花药绒毡层相比形态结构发生变化, 细胞排列不整齐, 空泡化, 出现解体, 花药开始出现败育现象。减数分裂期完成之前, 绒毡层全部解体(图4-F), 花粉母细胞也逐渐解体, 最终剩下空花粉囊。

2.4 TUNEL染色分析

在植物花药中, 绒毡层降解被认为是细胞程序性死亡(programmed cell dead, PCD)的结果, 其特征是细胞核DNA的断裂。为进一步研究160S-MS花药绒毡层发育的异常现象, 本研究使用TUNEL法观察绒毡层细胞凋亡情况(图5)。对160S-MF、160S-MS不同发育阶段的花药切片进行 TUNEL染色观察分析表明, 在花粉母细胞时期,160S-MF、160S-MS花药绒毡层细胞的细胞核均为TUNEL阴性(图5-A, B), 表明该阶段绒毡层细胞发育正常; 减数分裂期, 160S-MF并未检测到绒毡层凋亡信号(图5-C), 相比之下, 160S-MS花药绒毡层细胞在减数分裂期检测到绿色荧光信号(图5-D), 表明其绒毡层核DNA断裂, 细胞开始凋亡; 随着花药发育, 绿色荧光信号越强烈(图5-E), 最终只剩下空的花粉囊。四分体时期(图5-F),160S-MF花药绒毡层细胞核才出现微弱绿色荧光信号,绒毡层开始降解, 分泌小孢子从四分体释放出来所需的物质, 并且荧光信号持续到双核期(图5-G)。表明160S-MS花药绒毡层细胞在减数分裂期提前凋亡。

3 讨论

在本研究中, 160S-MS雄蕊明显退化, 花丝变短, 这些形态特征与大多数温敏甘蓝型油菜雄性不育材料相同。对 160S-MS醋酸洋红染色未观察到小孢子或者花粉粒,说明 160S-MS败育彻底, 由于雌蕊发育正常, 可以正常授粉。因此, 不育系 160S可以用于油菜两系育种, 培育新型杂交油菜品种。

在花粉发育过程中, 任何阶段的异常都会引起雄性不育, 败育发生时期和方式是多样的[18-19]。余凤群等[20]根据甘蓝型油菜雄性不育系花药败育时期和方式, 将其败育分为无花粉囊型不育系、花粉母细胞败育型不育系、单核败育型不育系3类。本研究发现, 不育系160S花药在减数分裂时期出现异常, 属于花粉母细胞败育型不育系。花粉母细胞不能完成减数分裂, 无法形成正常的四分体结构, 这一败育特征与 TE5A[14-15]败育现象非常相似。160S-MS花药绒毡层在减数分裂时期出现结构和形态出现异常, 细胞空泡化, 伴随提前解体, 然而, 不育系TE5A绒毡层发育正常。从绒毡层发育层面看, 160S-MS与373S[7]、SP2S[16]和Huiyou 50S[21]都出现提前凋亡, 但这些不育系材料在发育过程中能形成正常的四分体结构,败育发生在小孢子发育过程中, 而 160S-MS在花粉母细胞减数分裂未完成时, 就形成空的花粉囊, 未观察到四分体结构和小孢子。总之160S败育时期和特点与目前报道的甘蓝型温敏核雄性不育材料存在差异。

植物花粉的生长发育需要绒毡层在适当的时期发生细胞程序性死亡[22]。 绒毡层位于花药壁最内层, 它与发育中的雄配子体直接接触, 能向小孢子提供发育需要的营养物质, 如胼胝质、孢粉素和蛋白质等[23-26]。研究表明,绒毡层在花药和花粉的发育过程中发挥重要作用, 过早或延迟凋亡会导致雄性不育[27-29]。目前已在小麦[27]、拟南芥[30-31]、水稻[32-33]、油菜[34]等植物中发现大量雄性不育材料是由绒毡层发育异常引起的。李六林[35]根据前人对绒毡层发育的研究, 按照不同的植物种类, 将绒毡层解体分为 2类: 一种是腺质型类型, 在花粉发育过程中, 绒毡层细胞分泌花粉母细胞和小孢子发育所需的各种营养物质, 绒毡层细胞直到花粉成熟才完全消失; 另一种是变形绒毡层, 绒毡细胞以多核原生质团的形式填充于小孢子之间的空隙中, 供小孢子利用和吸收。腺质型绒毡层多存在于被子植物中。在花药发育早期, 160S-MS能形成正常的花粉母细胞, 绒毡层细胞整齐地排列在花药壁最内层, 与160S-MF无差异。然而, 在减数分裂期, 160S-MS花药绒毡层细胞形态和结构出现异常, 细胞空泡化并伴随降解现象, 致使花粉母细胞减数分裂受阻, 慢慢解体,无法形成四分体结构, 最终减数分裂完成前就只剩下空的花粉囊, 导致败育。可能是绒毡层细胞提前凋亡而未向腺质型转化, 不能向花粉母细胞提供发育所需的营养成分, 进而影响四分体小孢子的形成, 无成熟花粉粒产生,导致160S败育。