半滑舌鳎早期不同性别的形态差异及判别分析

王立萍，叶 展，张亚群，王巧欣，李恒德

（1.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.中国水产科学研究院生物技术研究中心，北京 100141）

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国近海水域常见的一种暖温性大型底层鱼类，其肉质细嫩、营养丰富，深受养殖户和消费者喜爱，是我国重要的海水经济鱼类。半滑舌鳎性别决定系统为（ZW♀-ZZ♂）型［1-3］，在苗种期，部分遗传雌性会逆转为表型雄性，即伪雄鱼（ZW♂），这种性别转变是不可逆的［4］。半滑舌鳎成年雌性的体质量是成年雄性的2～4倍［5］，雄性和伪雄性则存在着个体小、生长速度慢等缺点［6］。虽然半滑舌鳎刚孵化出的仔鱼的遗传雌、雄性别比例接近1∶1［7-9］，但是由于性逆转现象，导致雌性比例过低，从而增加了饲养和管理成本，影响整体养殖产量，严重阻碍了半滑舌鳎养殖产业的发展。

在鱼类中，具有明显两性性征的物种，可利用鳍条特征、生殖孔形态［10］、产卵管［11］、雄性体表的追星［12］和婚姻色有无［13］等特征鉴别性别，但对于外观特征不明显的物种，则可通过解剖观察、组织切片［14］、超声波［15-16］、强光照射［17］等方法鉴定，或从其基因组DNA中筛选出性别特异标记基因，采用PCR技术准确鉴定鱼体遗传性别，如黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）［18］、半滑舌鳎［19-22］、哲罗鱼（Hucho taimen）［23］、金钱鱼（Scatophagus argus）［24］、 鳗鲡 （Anguilla japonica）［25］、翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）［26］等。虽然同批次半滑舌鳎成体的雌、雄、伪雄性体质量差别较大，较易辨别，但在幼鱼期不同性别间差异则较小，不易辨别，需要养殖较长时间后才能依据体型大小差异基本辨别性别，这会在很大程度上增加养殖成本。在半滑舌鳎生产中，鱼苗一般在70日龄左右出售，此时鱼苗全长约5 cm左右。为了获得客户认可，育苗人员常常根据经验，将全长较短、体高较窄的貌似雄鱼个体淘汰，以期提高所售苗种的雌性率。但由于这个时期的鱼苗正处于性别分化时期，一些可能发育为伪雄鱼的遗传雌鱼还未完成性别逆转过程，这种经验式的筛选方式是否可靠，还缺少相应的科学依据。

通过测量大量样本的鱼体形态和框架指标，运用多元统计分析进行性别判定是一种较为简便、实用、有效的方法。目前已有多种水产鱼类通过测量鱼体各形态特征指标，运用主成分分析、判别分析等方法较为准确地判别雌、雄。如对大黄鱼（Larimichthys crocea）形态特征的主成分分析和判别分析发现，雌鱼较雄鱼变异大，雌雄个体间体长／体厚差异最大［27］；翘嘴鳜的全长和体高对体质量的影响最大［28］；金钱鱼的雌雄差异主要体现在头部和体型［29］；红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）雄性较雌性体型宽、体周长［30］。而目前有关半滑舌鳎形态指标的研究很少，且大都集中于成鱼，如利用相关性分析和通径分析方法判断半滑舌鳎形态性状与个体体质量的关系［31］，以及对半滑舌鳎的生长和形态参数方面进行研究［32］等。因此，本研究通过测量半滑舌鳎幼鱼雌、雄、伪雄个体的形态学测量数据，进行主成分分析和判别分析，检验通过形态特征对半滑舌鳎幼鱼进行早期性别判定的可行性和准确性，以期为半滑舌鳎生产中幼鱼的性别鉴定提供科学的数据支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

半滑舌鳎样品2019年采集于天津某养殖场，养殖水温23℃左右，随机捞取同批次的70日龄半滑舌鳎苗种，共计349尾，作为测量分析样本。由于部分半滑舌鳎雌性苗种在50～120日龄期间会发生性逆转现象，采用性腺组织切片的方法不能准确判定生理性别，故采用已知的半滑舌鳎性别特异基因位点的方法来准确鉴定各样本生理性别。对各样本分别取尾鳍提取基因组DNA，运用半滑舌鳎的特异微卫星标记SCAR进行初步的遗传性别鉴定［20］，区分出遗传雄性、遗传雌性，由于遗传雌性中可能含有会性逆转的生理性别为伪雄性的个体，之后通过半滑舌鳎遗传雌鱼Z染色体上两个与性逆转相关的单核苷酸多态性（SNP）位点［21-22］，扩增测序以准确辨别伪雄性和雌性。测序结果显示，本次样品中雌性116尾、雄性180尾、伪雄性53尾。雌性体长为3.154～7.959 cm，雄性体长为3.108～7.569 cm，伪雄性体长为3.569～6.489 cm。

1.2 形态学性状测量

取实验用鱼置于白色实验盘中，旁边放置钢尺，逐尾标号标记，水平拍照后，采用Motic Images Plus 2.0软件测量全长（吻端到尾鳍末端，FL）、体高（垂直于鱼体侧线最宽的部位，BH）、尾巴角度（CA）、背部与水平线角度（DA）等形态性状指标，精确至0.001 cm（图1）。

图1 半滑舌鳎幼鱼各形态测量指标Fig.1 Morphologicalmeasurement indexes of Cynoglossus sem ilaevis seed ling

1.3 数据处理

对收集到的349尾半滑舌鳎幼苗进行有效可量性状测量并统计。为消除个体差异对形态数据的影响，也便于差异比较，将测得的数据进行整理及标准化，考虑到数据连续性的问题，把角度值用正切转换为长度后再分析，共得到5项性状，包括全长（FL）、体高（BH）、全长／体高（FL／BH）、尾部角度正切值（CT）、背部与水平角度正切值（DT）。

1.4 统计分析

本研究应用Excel2016及R软件（R4.0.0），对样本各项形态测量数据进行处理分析。首先，将5项性状数据进行分布检验，明确各项数据是否基本呈现正态分布，并检验各项数据的方差齐性。以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。运用方差分析，将样本的雌、雄、伪雄3种性别类别作为因子，对各项形态测量数据进行方差分析，分析各性别间的差异显著性。之后，运用R中软件princomp（）函数对各项形态性状进行主成分分析，分析半滑舌鳎幼鱼不同性别群体间的形态变异特征和程度。然后运用R软件中lda（）函数进行Fisher判别分析，根据各变量对模型贡献的大小，建立70日龄半滑舌鳎雌、雄、伪雄个体判别方程式，并根据所建立的方程，对照鉴定的遗传性别信息，检验判别的准确性。

2 结果与分析

2.1 半滑舌鳎幼鱼雌、雄、伪雄形态性状分析

对349尾半滑舌鳎70日龄幼鱼雌、雄、伪雄性别样本的形态测量性状进行统计（表1）。经检验，样本中半滑舌鳎雌、雄、伪雄的各项测量数值均为正态性分布，且符合方差齐性（P＞0.05）。雌性群体的全长（FL）和体高（BH）大于雄性，全长／体高（FL／BH）小于雄性，且均有显著差异（P＜0.05）；雌、伪雄群体间，只在全长／体高（FL／BH）方面差异显著（P＜0.05）；雄鱼和伪雄鱼的形态性状则无显著差异。从以上统计可以得知，雌鱼的整体轮廓较同期雄鱼和伪雄鱼更为宽大。

2.2 主成分分析

对半滑舌鳎早期幼鱼样本的5个形态测量性状，运用R软件princomp（）函数进行主成分分析，结果表明，前3个主成分（PC1、PC2、PC3）的特征值较大，它们的贡献率分别为39.011%、27.976%、19.045%，累计贡献率达到86.032%（表2）。其中PC1负荷量较大的有全长（FL）和体高（BH），主要反映半滑舌鳎整体轮廓大小特征；PC2负荷量较大的为尾巴角度正切值（CT）和全长体高比（FL／BH），反映了鱼体的宽度大小以及尾巴角度的影响；PC3主要负荷量较大的为背部与水平线角度（DT）和全长体高比（FL／BH），主要反映视觉上鱼体的长宽比。

根据主成分分析的结果，绘制半滑舌鳎早期个体样本的主成分得分散点图。如图2所示，尽管分散不明显，但仍表现出分离态势，雌性个体整体得分较高，趋于图的上部分，雄性个体得分趋于图的下部，伪雄性个体分散于图片中部。

2.3 判别分析

由于主成分分析只能揭示半滑舌鳎不同性别群体间形态变异的特征和程度，无法判别单一半滑舌鳎的性别，因此需要进行判别分析。进一步对349尾半滑舌鳎个体的5项形态测量性状进行判别分析，根据各变量对模型的贡献率，所建立的判别模型方程为：

第一判别式LD1对区分雌、雄、伪雄的贡献率大小为0.813 7，第二判别式LD2对区分各性别组的贡献率为0.186 3，误判率为0.435 5。判别函数的显著性检验显示P＜0.01，达到极显著水平。利用所建立的判别方程，对349尾半滑舌鳎雌、雄、伪雄个体性别进行判别检验。其中，雄性个体判别准确率较高，为85.000%；雌性个体判别准确率较低，为37.069%；伪雄鱼个体判别准确率极低，为1.887%，伪雄鱼形态特征不明显且更易判为雄鱼；综合判别准确率为56.447%（表3）。

3 讨论

分析不同性别鱼体间的形态特征差异，建立形态指标体系，进行雌雄差异判别，是一种可行、有效的方法［33-35］。本研究针对生产中通过观察半滑舌鳎幼鱼形态来判断性别的科学性问题，建立了3种性别判别模型方程进行判别检验，相关结果对能否通过体型差异淘汰雄性和伪雄性个体，以提高商品苗的雌性率提供了重要的理论依据。

表1 半滑舌鳎雌、雄、伪雄形态性状的参数统计（N=349）Tab.1 Statistics ofmorphological characters of female，male and pseudomale in Cynoglossus sem ilaevis

表2 主成分贡献率及各指标负荷量Tab.2 Contribution rate of principal com ponents and load capacity of each index

本研究发现，雌性幼鱼整体轮廓较雄性和伪雄性大，且腹部较宽，而雄鱼和伪雄鱼在形态上较为相似，这与其成体的外部形态也较为一致［7］。雌、雄、伪雄性个体间存在的这种形态差异，与其体内性激素水平、性成熟时间有关，卵巢和精巢的细胞学分化通常不同步，雄鱼较雌鱼成熟所需时间短［36］。

本研究应用主成分分析方法，对可能反映半滑舌鳎不同性别形态差异的多维空间相关变化的数据集，降维转化为少量且相互独立的新综合指标，从而简化数据结构，并包含原指标中的主要信息。由主成分分析结果可知，提取的3个主成分（PC1、PC2、PC3）的累计贡献率达86.032%，表明该方法既可保留变量间的大部分信息，又能够保证较高的预测准确度。根据主成分分析得分情况可知，对性别分离作用较大的主要是全长、体高及其比值方面，表明半滑舌鳎雌、雄、伪雄性个体间的差异主要集中在整体轮廓大小的指标方面，这与其形态性状差异显著性分析的结果相符，可为半滑舌鳎幼鱼性别判别、筛选培育高雌群体提供重要理论参考。

同时，判别分析是一种实用性很强的统计判别和分组技术，已有多种鱼类通过本方法有效区分不同性别群体，如长江口鳗鲡的雌雄判别准确率为88.59%［37］，金钱鱼的雌雄综合判别准确率为85.96%［29］，红鳍东方鲀的性别综合判别准确率为 81.90%［30］，河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）雌雄综合判别准确率为71.0%［33］，翘嘴红鮊（Eryghroculter ilishaeformis）群体的识别正确率达91.0%［38］，翘嘴鳜雌、雄综合判别准确率为61.7%［28］。本研究的检验结果显示，半滑舌鳎70日龄幼鱼雄性判别准确率为85%，可筛选淘汰大部分雄鱼，雌性个体判别准确率为37%，伪雄鱼个体易判为雄鱼，伪雄鱼的生长速度虽较雄鱼稍快，但较正常雌鱼慢，由于需要淘汰伪雄鱼，因此尽管其判定准确性低，但是并不影响实际应用。本研究显示，雌性判别率较低，相当一部分雌性个体存在易错判为雄性个体而被淘汰掉，从而造成一定程度的苗种浪费，但由于生理雄鱼的判别率较高，因而更容易被淘汰掉。所以总体上看，根据形态学性状建立的判别方法可在70日龄左右区别并淘汰雄鱼及伪雄鱼，从而在一定程度上提高苗种的雌性率，但同时也会把一部分雌鱼淘汰掉。

表3 70日龄半滑舌鳎性别判别结果Tab.3 Discrim inant results of sexual discrim ination of 70 days Cynoglossus sem ilaevis

综上，本研究利用70日龄半滑舌鳎雌、雄、伪雄性别的形态差异建立判别模型，其雄鱼判别准确率达85%，较之前通过强光照射方法肉眼判断雄鱼54.7%的准确率［17］有了较大提高，为生产上通过观察幼鱼形态指标、筛选淘汰雄性个体、提高商品苗的雌性率提供了科学依据。各性别鱼体在生长过程中，由于体型的增大，全长／体高的比值会随之变化，所以不易固定量化。但对于同一批次鱼而言，大致符合雄鱼比雌鱼全长较短、体高较窄的特点。早期淘汰雄鱼和伪雄鱼会使一定比例的雌鱼淘汰掉。由此建议半滑舌鳎早期苗种的筛选时间进行适当的推迟，如120日龄，此时鱼体性别已完全分化，但同时也会增加苗期的养殖成本，因此在实际生产中需综合权衡，以达到养殖效益最大化。